牛源解淀粉芽孢桿菌產纖維素酶活力測定、抗逆性及藥敏試驗（一）
摘要
本試驗旨在篩選具有良好耐受性、抑菌活性及高產纖維素酶的菌株，為后續飼用微生態制劑的開發研究提供優質菌株。首先將處理好的牛糞樣原液通過羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)培養基進行選擇性培養，經剛果紅染色初篩及DNS法復篩后，篩選出具有良好耐受性和抑菌活性且高產纖維素酶的菌株;隨后對目標菌株進行形態學、生理生化、16S rDNA鑒定和單因素發酵條件優化，同時進行藥敏、抗逆性、體外抑菌、溶血性試驗，驗證其益生特性及安全性。結果顯示:本試驗成功篩選出了1株高產纖維素酶的解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)，所產纖維素酶活力最高可達126.37 U/mL，對人工胃液、人工腸液具有良好的耐受性，且對大腸桿菌、結核桿菌、金黃色葡萄球菌均具有抑菌作用，對大部分常用抗生素敏感且不具有溶血性，無可移動耐藥基因及毒力基因，無致病性基因。綜上所述，本試驗從牛糞便中分離出的解淀粉芽孢桿菌具有良好的益生潛力和安全性，可作為飼用益生菌候選菌株。
飼料成本約占畜禽生產總成本的70%，因此提高動物對飼料的利用率是降低生產成本、提高養殖效益的最佳途徑。飼料效率指用于滿足畜禽生產和維持需要的飼料的占比，它是畜牧業生產中一項重要的經濟性狀。Hamann等的研究表明，溫度上升、二氧化碳濃度增加、干旱和營養狀況差異等情況，直接或間接影響了草食動物對食物的消耗。纖維素是一種大分子多糖，不溶于水和一般有機溶劑，是植物中主要的多糖化合物，主要用于形成植物細胞壁，因此植物性飼料中存在大量纖維素。但由于哺乳動物自身不能產生分解纖維素的纖維素酶，因此在飼糧中添加能產纖維素酶的微生物制劑是一種有效地提高飼料利用率的途徑。纖維素分解菌群是草食動物重要的腸道菌群之一，能夠促進纖維性飼料的有效分解、消化和吸收，從而提高動物的生產能力。
目前，微生物飼料添加劑涉及的菌株有乳酸桿菌、芽孢桿菌、真菌等。其中，芽孢桿菌能夠產生降解飼料中各類多糖的豐富酶類，如果膠酶、葡聚糖酶、纖維素酶等，能充分破壞植物性來源飼料的細胞壁，使細胞中的各類營養物質釋放出來。芽孢桿菌還可產生多種抗菌物質，具有促進動物體生長、抑制病原的優點。近年來有關牛源益生芽孢桿菌的研究有一定的報道，如奶牛瘤胃液和腸道內容物中產酸和抗氧化芽孢桿菌的分離鑒定和益生性質分析，菌株來源主要集中在我國北部地區，且只通過16S rDNA分子檢測進行鑒定，并不能全面地分析菌株的功能特性。本試驗通過全基因組序列分析和功能預測并結合益生特性試驗，從廣西北部灣地區健康肉牛糞便中篩選高產纖維素酶、具有抑菌活性的潛在益生菌株，為后續進一步開發反芻動物飼用微生態制劑提供優秀候選菌株。
1材料與方法
1.1試驗材料
1.1.1樣品
牛糞樣品采集自廣西南寧某大型肉牛養殖基地。
1.1.2培養基
羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)培養基:蛋白胨2.5 g，酵母粉2.5 g，CMC-Na 2.5 g，磷酸二氫鉀0.25 g，氯化鈉1.25 g，瓊脂5.0 g，蒸餾水1 000 mL，調節pH至7.2，121℃滅菌20 min。
種子培養基:蛋白胨0.5 g，牛肉膏1.0 g，酵母粉0.5 g，葡萄糖0.5 g，氯化鈉0.5 g，蒸餾水100 mL，121℃滅菌20 min。
發酵產酶培養基:蛋白胨0.75 g，酵母浸粉0.125 g，硫酸銨0.5 g，磷酸二氫鉀1.0 g，氯化鈉0.075 g，硫酸鎂0.075 g，CMC-Na 5.0 g，蒸餾水250 mL，121℃滅菌20 min。
哥倫比亞血瓊脂培養基和LB培養基購自青島海博生物技術有限公司，NB培養基購自北京索萊寶科技有限公司。
1.2試驗方法
1.2.1牛糞樣品處理
取新鮮牛糞樣1.0 g，置于9 mL無菌生理鹽水中，37℃、搖床200 r/min振蕩培養0.5 h使其充分混勻后，置于75℃水浴鍋中水浴15 min，以殺死非芽孢菌體，然后86×g離心10 min，使糞樣中雜質沉淀。
1.2.2產酶菌初篩
將處理好的牛糞樣原液用無菌水梯度稀釋至10-1~10-6，無菌吸取10-4、10-5、10-6上清液200μL，均勻涂布至CMC-Na培養基上，37℃培養2 d;在平板上加入剛果紅染液(1 mg/mL)，靜置0.25 h后棄染液，加入4%的氯化鈉溶液，沖洗脫色后，向平板中加入4%氯化鈉溶液靜置脫色0.5 h。若菌落周圍出現透明圈即為陽性，測定透明圈直徑和菌落直徑，計算酶活指數(EI，透明圈直徑/菌落直徑)，并將其接至LB固體培養基劃線培養純化3次，得到純化菌株。
1.2.3細菌鑒定
1.2.3.1形態學鑒定
將純化后的待測菌株接種至LB固體培養基上進行劃線，使其長出單個菌落，觀察菌株形態及大小，并對其進行革蘭氏染色后鏡檢。待測菌株掃描電鏡圖片委托湖北塞維爾生物科技有限公司拍攝。
1.2.3.2生理生化鑒定
參考《伯杰氏細菌鑒定手冊》對純化后的待測菌株進行生理生化鑒定。
1.2.3.3 16S rDNA鑒定
將純化后的待測菌株接種至LB固體培養基中，用chelex-100法提取DNA。以提取的菌株DNA為模板，用細菌通用引物27F/1492R擴增16S rDNA基因序列。PCR體系(20μL):2×Taq MasterMix 10μL，上、下游引物各0.4μL，DNA模板1μL，Sterile Water 8.2μL。擴增程序:94℃預變性2 min;94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，共進行30個循環。將PCR產物委托武漢奧科鼎盛生物科技有限公司進行測序，所得序列通過EzBioCloud比對進行同源性分析。
1.2.4目標菌株產纖維素酶活力測定
1.2.4.1粗酶液制備
將目標菌株接種至50 mL種子培養基中，培養18 h后將其接種至發酵產酶培養基中，37℃、搖床180 r/min振蕩培養2 d，取5 mL發酵液1 760×g離心10 min，所得上清液為粗酶液。
1.2.4.2葡萄糖標準曲線繪制
分別吸取1 mg/mL葡萄糖標準液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2和1.4 mL置于比色管中，用蒸餾水補充至1.5 mL，再加2 mL DNS試劑，充分混合后在沸水中煮5 min，冷卻后定容至15 mL。用酶標儀于540 nm處測定吸光度(OD)值。以葡萄糖濃度(mg/mL)為橫坐標，對應的OD值為縱坐標，繪制葡萄糖標準曲線。
1.2.4.3濾紙酶活力測定
濾紙酶活力測定:取4支15 mL試管，在試管中加入1.5 mL醋酸-醋酸鈉緩沖液和0.5 mL粗酶液;4支試管50℃預熱10 min，將定量濾紙剪成50 mg的小條作為底物，卷成小卷后置于其中3支試管內，剩余1支不放濾紙作空白對照，并于該溫度下反應60 min，取出樣品后每個樣品內立即加入2.0 mL DNS試劑，于100℃水浴5 min，取出后冷卻定容至15 mL，通過酶標儀測出每個樣品的OD值，將測得的OD值換算成葡萄糖濃度。
1.2.4.4纖維素酶活力計算
纖維素酶活力定義:在50℃條件下，1 mL粗酶液在1 min內水解底物生成1μg葡萄糖所需的酶量為1個纖維素酶活力單位(U/mL)。
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