牛源解淀粉芽孢桿菌產纖維素酶活力測定、抗逆性及藥敏試驗（三）
2.6體外抑菌試驗結果
菌株GXUN13068-1體外抑菌試驗結果見表5。菌株GXUN13068-1的發酵液、菌懸液對3種致病菌均具有抑菌活性，上清液只對結核桿菌具有抑菌活性，其中菌株GXUN13068-1發酵液對結核桿菌的抑制效果最為明顯，圈徑比高達2.6以上。從體外抑菌試驗結果可看出菌懸液和發酵液對病原菌的抑制效果較上清液明顯，由此可以判斷出GXUN13068-1的抑菌作用主要依賴于菌體本身。
表5菌株GXUN13068-1對不同病原指示菌的抑菌活性
2.7溶血活性試驗結果
金黃色葡萄球菌和菌株GXUN13068-1在哥倫比亞血瓊脂培養基上的生長形態如圖7所示，金黃色葡萄球菌在培養基上出現界限分明，有完全透明的β溶血圈(圖7-a)，而菌株GXUN13068-1在培養基上無溶血圈(圖7-b)，說明菌株GXUN13068-1無溶血活性。
圖7菌株GXUN13068-1的溶血活性
2.8全基因組測序分析
2.8.1測序與組裝結果分析
通過對菌株GXUN13068-1進行測序評估和組裝，拼接得到菌株GXUN13068-1的基因組環狀圖譜(圖8)，該菌株全長4 070 064 bp，有2個重疊群(contigs)，GC含量為46.46%，共有3 883個蛋白質編碼序列(CDS)，30個核糖體RNA(rRNA)、93個轉運RNA(tRNA)和1個轉運-信使RNA(tmRNA)被注釋。
圖8菌株GXUN13068-1的基因組環狀圖譜CDS:蛋白質編碼序列coding sequence;tRNA:轉運RNA transfer RNA;rRNA:核糖體RNA ribosomal RNA;Other:其他;GC content:GC含量;GC skew+:G含量大于C含量the G content is greater than the C content;GC skew-:G含量小于C含量the G content is less than the C content。
2.8.2基因組功能注釋及預測
2.8.2.1 GO數據庫注釋結果
菌株GXUN13068-1在GO數據庫分析中共有32 654個基因被注釋(圖9)，其中屬于生物學過程(biological process，BP)的有21 809個，占比66.79%;屬于細胞組分(cellular component，CC)的有47 42個，占比14.52%;屬于分子功能(molecular function，MF)的優6 103個，占比18.69%。在生物學過程中，與代謝相關的基因最多，包括代謝過程(577個基因)、細胞過程(577個基因)、有機物代謝過程(522個基因)等;在細胞組分中，主要與細胞(611個基因)、細胞部件(611個基因)、細胞內(363個基因)等有關;在分子功能上，主要與催化活性(501個基因)、結合(224個基因)、轉移酶活性(188個基因)等有關。同時，還注釋到抗逆性基因，如制孢調控(GO:0043937)、產孢(GO:0030435)等。上述結果表明，菌株GXUN13068-1具有較強的代謝能力及環境適應能力。
圖9菌株GXUN13068-1基因組GO功能分類
2.8.2.2 CAZy數據庫注釋結果
將菌株GXUN13068-1基因組與CAZy數據庫進行比對，結果(圖10)顯示有55個基因被成功注釋，其中最多的是糖苷水解酶(glycoside hydrolases，GH)基因(25個)，隨后依次為糖基轉移酶(glycosyl transferases，GT)基因(23個)、碳水化合物結合模塊(carbohydrate-binding modules，CBM)基因(5個)、碳水化合物酯酶(carbohydrate esterases，CE)基因(1個)和輔助氧化還原酶基因(auxiliary activities，AA)(1個)。在注釋到的基因中，編碼纖維素酶的基因(GH5家族)有2個，編碼淀粉酶的基因(GH13家族)有6個，編碼木聚糖酶的基因(GH43家族)有4個，編碼糖基水解酶的基因(GH32家族)有3個。由此可知，菌株GXUN13068-1具有較強的碳水化合物水解能力。
圖10菌株GXUN13068-1基因組CAZy功能分類GT:糖基轉移酶glycosyl transferases;GH:糖苷水解酶glycoside hydrolases;CBMs碳水化合物結合模塊carbohydrate-binding modules;CE:碳水化合物酯酶carbohydrate esterases;AA:輔助氧化還原酶auxiliary activities。
2.8.2.3毒力基因注釋結果
將菌株GXUN13068-1基因組與VFDB數據庫進行比對，篩選一致性(identity)≥70%的基因，共找到7個毒力基因，如表6所示，其中2個基因與應激生存有關，2個基因與黏附有關，2個基因與免疫調控有關，1個基因與營養代謝因子有關，無可移動毒力基因，無致病性有關基因。
表6菌株GXUN13068-1注釋到的毒力基因
2.8.2.4耐藥基因注釋結果
將菌株GXUN13068-1基因組與CARD數據庫進行比對，篩選identity≥80%的基因，共找到2個耐藥基因——EmrB與GdnD，無可移動耐藥基因。EmrB屬于ATP結合盒抗生素外排泵(ATP-binding cassette antibiotic efflux pump)基因家族，對林可胺類抗生素具有抗性。GdnD屬于小多藥耐藥抗生素外排泵(small multidrug resistance antibiotic efflux pump)基因家族，對氨基糖苷類抗生素、四環素類抗生素、酚類抗生素具有抗性。
3討論
從動物腸道微生物中篩選益生菌株并將其作為飼用益生菌添加到動物飼糧中，是一種常用并且高效的益生菌資源開發利用途徑。哺乳動物不能自身產生纖維素酶，所需纖維素酶是由胃腸道微生物產生，因此草食動物的糞便是篩選產纖維素酶菌的重要來源，而芽孢桿菌的高抗逆性和高產纖維素酶量使其成為纖維素降解菌研究中的重要菌種。例如，田思齊等從大熊貓糞便中篩選到2株枯草芽孢桿菌，所產纖維素酶活力分別高達339.48和293.65 U/mL;姜立春等從麥洼牦牛糞便中分離出1株溶桿菌，所產纖維素酶活力為11.88 U/mL。本試驗從牛糞便中篩選出的菌株GXUN13068-1為解淀粉芽孢桿菌，所產纖維素酶最高活力可達126.37 U/mL，產酶效果相對比較理想。
腸道中有益菌增殖有利于提高動物健康和生產力。Wu等研究發現，飼料中添加復合益生菌對提高錦鯉抗氧化能力、血漿生化參數以及腸道形態和微生物群有正向影響，提高了錦鯉的生長性能。Jadamus等研究發現，飼糧中添加枯草芽孢桿菌能顯著提高肉雞的生長性能，且對肉雞的腸道菌群產生了有益影響。Markowiak等綜合分析后認為，飼糧中添加單一益生菌菌劑或者復合益生菌菌劑均能促進養殖動物對飼料中養分的消化和吸收，從而促進動物體的生長。Youngblut等的研究表明，在整個進化過程中，腸道微生物群和動物宿主之間有著密切的聯系。Goel等的研究表明，腸道微生物群和膳食因子之間的相互作用產生了纖維素水解酶，這有助于木質纖維素的降解。反芻動物的腸道內存在多樣性厭氧菌，對纖維素具有良好的降解能力。腸道菌群通過促進營養供應、消化和吸收，提高動物的生長性能，減少病原體定植，并維持正常的黏膜免疫，兼具有代謝、營養和防御作用。而從動物糞便中分離出的菌株來源于動物本身，能較好地適應動物體內胃腸道環境，容易定植。
芽孢桿菌作為具有廣譜桿菌活性的革蘭氏陽性菌，能產生細菌素抑制病原微生物。于秀菊等從羊駝腸道中分離出1株地衣芽孢桿菌，該菌株對金黃色葡萄球菌等3種致病菌具有顯著抑制效果，并能改善小鼠腸道形態，提高了鼠腸道益生菌相對豐度。朱靜靜等從加州鱸腸道中分離出1株枯草芽孢桿菌，該菌株具有拮抗諾卡氏菌的效果，并促進了加州鱸的生長，減少加州鱸腸道炎癥的發生。本試驗從牛糞便中分離出的1株解淀粉芽孢桿菌對大腸桿菌等腸道病原菌具有抑制作用，表明此菌株具有作為微生物飼料添加劑代替抗生素使用的潛能。
耐藥基因和毒力基因注釋結果顯示，菌株GXUN13068-1僅有2個耐藥基因，無可移動耐藥基因及毒力基因，無致病性基因，與其他具有潛在毒力的基因相似度低于80%。因此，可以認為菌株GXUN13068-1具有較高的安全性。此外，通過與GO數據庫比對，發現菌株GXUN13068-1含有多個抗逆性基因，為其耐受人工胃液和人工腸液提供了依據，表明菌株GXUN13068-1具有很強的環境適應能力及代謝能力;通過與CAZy數據庫比對，發現菌株GXUN13068-1含有多種水解酶，能夠水解纖維素、木聚糖、淀粉等多種碳水化合物，具有較高的碳水化合物水解能力。
4結論
本試驗從牛糞便中分離出1株高產纖維素酶的解淀粉芽孢桿菌，該菌株對胃腸道環境具有良好的耐受能力，沒有溶血性，對大部分抗生素敏感，對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和結核桿菌具有明顯的抑菌效果，無可移動耐藥基因及毒力基因，無致病性基因，具有成為飼用益生菌的潛力。
相關新聞推薦
1、諾卡菌菌株分離、鑒定、抗菌藥物敏感性試驗——摘要、材料與方法
3、嗜黏蛋白阿克曼菌在硫乙醇酸鹽液體培養基中的生長情況與代謝產物（二）