O 型口蹄疫病毒 3D 突變體重組 FMDV 的鑒定及生長曲線的測定（三）
2.5 重組病毒的生物學(xué)特征
2.5.1 生長特性 生長曲線測定（圖 5）表明，rFMDV-M403A 的復(fù)制動(dòng)力學(xué)與 rFMDV-WT 相似，且突變毒株的生長速度較野生毒株有所減慢，病毒滴度顯著低于親本病毒，但仍能在細(xì)胞培養(yǎng)體系中有效增殖。 說明 FMDV 的 3D 蛋白在 403 位上的甲硫氨酸突變成丙氨酸影響了病毒在 BHK21 細(xì)胞上的復(fù)制，使病毒毒力降低。
2.5.2 臨床致病性評(píng)估 傳代穩(wěn)定的突變毒株 rFMDV-M403A 和親本毒株 rFMDV-WT 分別接種乳鼠 1 d 后，觀察到接種 rFMDV-WT 的部分乳鼠出現(xiàn)呼吸困難、四肢僵硬等癥狀。 3 d 之后出現(xiàn)癥狀的乳鼠陸續(xù)死亡。 4 d 之后，接種 rFMDV-WT 毒株的乳鼠全部死亡，而接種 rFMDV-M403A 的乳鼠正常（圖 6A）。 對死亡與存活的乳鼠，收集乳鼠的肝用于病毒載量測定及組織病理學(xué)分析。 如圖 6B 所示，在接種 rFMDV-M403A 病毒的乳鼠中與接種rFMDV-WT 病毒的乳鼠相比，肝的病毒載量顯著降低。 組織病理學(xué)分析顯示，感染 rFMDV-WT 的乳鼠肝出現(xiàn)大面積壞死和充血，而接種 rFMDV-M403A 的乳鼠肝的損傷程度較低（圖 6C）。
圖 5 突變毒株 rFMDV-M403A 和親本毒株 rFMDV-WT生長曲線的測定
3 討論
隨著 FMDV 反向遺傳操作技術(shù)的快速發(fā)展與日益成熟，疫苗研發(fā)領(lǐng)域迎來了高效且強(qiáng)大的新工具。 借助這項(xiàng)技術(shù)，科研人員能夠在 DNA 層面對病毒基因進(jìn)行精確操作，包括替換、缺失及修飾等，以滿足特定需求。 通過這些操作，成功地拯救出預(yù)期的重組病毒，并在 FMD 疫苗研發(fā)領(lǐng)域取得了顯著的突破與成就。 因此，可以在 DNA 層面對 FMDV 的全基因組實(shí)施改造，以探究基因組變化如何影響病毒的功能。 在此基礎(chǔ)上，還可以進(jìn)一步深入研究病毒基因組的結(jié)構(gòu)特征、功能作用以及分子免疫機(jī)制等。 這些研究將為開發(fā)新型口蹄疫疫苗提供有力的支持。
本研究以 O 型口蹄疫的 3D 蛋白為研究對象，對 3D 蛋白的關(guān)鍵位點(diǎn)進(jìn)行突變，擴(kuò)增出片段，該片段替換到本實(shí)驗(yàn)室所保存的 O 型口蹄疫病毒拯救系統(tǒng)上，然后直接轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞后，得到了重組質(zhì)粒。該方法使重組毒的構(gòu)建過程得到了極大的簡化，提高了構(gòu)建效率，并且該重組毒株能夠很好地與流行毒株進(jìn)行抗原適配。 由于 FMDV 的 3D 蛋白在 FMDV 的復(fù)制過程中起著很重要的作用，所以，對 3D 蛋白進(jìn)行改造為未來的重組毒的構(gòu)建以及疫苗的研發(fā)創(chuàng)造了更多的思路，甚至可以延伸至小 RNA 病毒科，對小 RNA 病毒家族其他成員創(chuàng)造了更多的研究對象。
本研究成功構(gòu)建了 O 型口蹄疫病毒 3D 蛋白的突變毒株，并對其生物學(xué)特征進(jìn)行了多方面分析。結(jié)果表明，在比較 rFMDV-M403A 和 rFMDV-WT 的生長特性后發(fā)現(xiàn)，3D 蛋白的 403 位點(diǎn)突變之后會(huì)使病毒滴度顯著下降，細(xì)胞出現(xiàn) CPE 時(shí)間較晚。 對傳代穩(wěn)定后的細(xì)胞毒株進(jìn)行測序，驗(yàn)證了 3D 蛋白的 403 位點(diǎn)氨基酸能夠穩(wěn)定突變。 在個(gè)體水平上，3D 蛋白上 403 位點(diǎn)的氨基酸突變會(huì)使乳鼠的存活率大大提高，并且在肝中病毒載量和組織病變顯著降低。所以，F(xiàn)MDV 的 3D 基因突變對病毒的生長特性、致病性均產(chǎn)生了顯著影響。 3D 突變毒株生長速度減慢可能是由于 3D 蛋白在病毒復(fù)制過程中的功能受到了抑制。 致病性降低為開發(fā)免疫應(yīng)答更好的 O 型 FMD 疫苗提供了可能。同時(shí)，突變毒株具有一定的免疫原性，有望成為疫苗候選株。 然而，進(jìn)一步的研究還需要深入探討 3D 基因突變對病毒其他生物學(xué)特性的影響，以及優(yōu)化突變毒株的免疫效果和安全性。
圖 6 突變毒株 rFMDV-M403A 和親本毒株 rFMDV-WT 在乳鼠中的致病性分析
A：乳鼠感染 rFMDV-WT 與 rFMDV-M403A 通過背部皮下注射途徑。 每天檢測乳鼠生存。B：收集乳鼠肝，用 RT-qPCR 定量病毒載量。C：HE 染色顯示病理變化，黑色箭頭所指壞死細(xì)胞碎片。 表示差異顯著，P＜0.01。
4 展望
本研究成功培育的 O 型口蹄疫病毒 3D 突變體展現(xiàn)出了獨(dú)特的生物學(xué)特性，為口蹄疫的預(yù)防與控制開辟了新穎的思路與探索路徑。 未來的研究工作將著重于提升該突變體的效能、研制創(chuàng)新型疫苗，并深化對口蹄疫病毒致病機(jī)理的認(rèn)識(shí)，以期在促進(jìn)畜牧業(yè)穩(wěn)健發(fā)展中發(fā)揮更加積極的作用。-
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