鴨瘟病毒基因缺失株rDEV-ΔVP26生長曲線、蝕斑面積及免疫原性分析（一）
摘要
為研究鴨瘟病毒(duck enteritis virus，DEV)UL35基因缺失DEV疫苗株的生物學特性和對強毒株攻擊的免疫保護效果，本研究在鴨瘟病毒疫苗株感染性克隆pDEV-EF1基礎上，通過“Red E/T兩步重組”技術，構建了UL35基因缺失的pDEV-ΔVP26突變體克隆，并轉染雞胚成纖維細胞(CEFs)獲得了重組病毒rDEV-ΔVP26，進而對重組病毒細胞生物學特性和免疫保護能力進行了評估。病毒一步生長曲線測定表明，rDEV-ΔVP26的滴度從24~84 h穩步上升，達到峰值105.36 TCID50·0.1 mL-1。在此期間，rDEV-ΔVP26滴度較親本毒株rDEV-EF1相比有所降低。蝕斑面積測定發現rDEV-ΔVP26蝕斑面積較親本株rDEV-EF1減少了10.60%，說明UL35基因缺失會輕微影響病毒擴散并降低病毒滴度。動物試驗表明，1×106 TCID50的rDEV-ΔVP26對30日齡麻鴨無致病作用，且1×105 TCID50滴度的rDEV-ΔVP26免疫組在強毒株攻擊下的保護率與相同劑量的rDEV-EF1對照組一致。該研究表明，UL35為DEV復制非必需基因，且當接種合適劑量的病毒液時，UL35缺失不影響鴨瘟病毒疫苗株的免疫保護效果。該研究為研發用于區分疫苗免疫和野毒感染的DEV鑒別診斷疫苗奠定了基礎。
鴨瘟病毒(duck enteritis virus，DEV)，又稱鴨皰疹病毒Ⅰ型(Anatid alphaherpesvirus 1)，屬于皰疹病毒科(Herpesviridae)，ɑ皰疹病毒亞科(Alphaherpesvirinae)，馬立克病毒屬(Mardivirus)。鴨瘟病毒呈球形，直徑為160~180 nm，主要是由核心、衣殼、皮層、囊膜四個部分組成，基因組為雙股線狀DNA，長約158 kb，由長獨特區(UL)、短獨特區(US)以及內部重復(IR)與US兩側的末端倒轉重復(TR)組成。DEV主要感染鴨、鵝及其他雁形目禽類，發病迅速、傳染性強、死亡率高，嚴重損害鴨養殖行業的經濟損失。鴨群感染鴨瘟病毒主要臨床癥狀有體溫發熱至43℃以上、不進食、流淚、無精打采、排白色或綠色稀軟糞便、頭腫大，俗稱“大頭瘟”。剖檢結果可看到食道、直腸和泄殖腔出血、甚至形成假膜，難以剖離，肝臟有白色出血點、脾腫大等病變。疫苗接種是預防該病的重要手段，但目前實際生產中免疫的鴨瘟疫苗為傳統減毒活疫苗，誘發機體產生的抗體與野毒感染無法區分，亟需一種與傳統疫苗具有同等保護效果且控制生產成本的可標記疫苗，用來開展鑒別診斷，從而用于鴨瘟的防控和凈化。
皰疹病毒基因組編碼多種蛋白參與組成病毒的核衣殼，主要由UL18、UL19、UL26、UL26.5、UL35和UL38等基因產物組成，其中UL35基因是皰疹病毒特定長區的基因，大小為354 bp，編碼VP26蛋白，VP26為最小衣殼蛋白，通過與主要衣殼蛋白VP5結合而位于六鄰體上，從而修飾衣殼，主要參與病毒粒子的晚期包裝。VP26對于病毒復制和組裝都是非必需的，但參與核衣殼的成熟和出芽。VP26是唯一一個不需要參與HSV-1復制的衣殼蛋白。它是病毒DNA有效包裝及病毒核衣殼蛋白正確定位所必需的，它能通過促進病毒衣殼蛋白UL25整合至病毒衣殼從而調控病毒核衣殼成熟。VP26蛋白與病毒神經毒力相關，VP26缺失導致細胞培養中病毒滴度降低，UL35基因缺失HSV-1在小鼠中樞神經系統中的復制受到嚴重影響，提示VP26可能與病毒從潛伏期到再激活的過程有關。
為了闡明鴨瘟病毒VP26的生物學功能和VP26基因缺失株的免疫保護效果，本研究在鴨瘟病毒全長感染性cDNA克隆的基礎上，采用“Red E/T兩步重組技術”刪除UL35基因，構建了UL35基因缺失的DEV感染性克隆，并拯救獲得了基因缺失重組病毒，對重組病毒rDEV-ΔVP26的細胞生物學特性進行了研究，隨后在鴨體上對其安全性和免疫保護能力進行了評估。
1材料與方法
1.1質粒載體、菌株和病毒株
pEPkanS質粒由德國柏林自由大學Osterrieder N博士惠贈；E.coli DH5α、DH10B、BL21(DE3)菌株由本實驗室保存。DEV疫苗株全長感染性克隆pDEV-EF1及相應病毒rDEV-EF1由本實驗室構建并保存。鴨瘟病毒強毒株CHv(CVCC AV1221)購自中國獸醫藥品監察所。
1.2工具酶和試劑
DNA限制性內切酶、T4 DNA連接酶、Primestar DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、膠回收試劑盒購自TaKaRa(大連)公司；DMEM培養基購自吉諾生物醫藥技術有限公司；磷酸鈣轉染試劑購自Promega公司；甲基纖維素購自Sigma公司；胎牛血清購自Gibco公司；胰酶購自Difico公司。FuturePAGETM蛋白預制膠(4%~20%)購自ACE生物技術公司，ECL化學發光試劑盒購自TaKaRa(大連)公司。
1.3試驗用SPF雞胚和實驗動物
9~11日齡SPF雞胚購自寧波純派農業科技有限公司。30日齡的DEV抗體陰性麻鴨購自杭州蕭山漢朝家禽有限公司。本研究方案、程序和內容符合涉及動物實驗研究的倫理要求，批準文件號為2021ZAASLA66。
1.4 DEV UL35基因缺失突變體的構建
采用“兩步Red E/T重組技術”構建DEV疫苗株UL35基因缺失株。第一步Red重組以卡那霉素(Kan)抗性基因替代UL35基因序列。以引物DEV-ΔVP26-for和DEV-ΔVP26-rev擴增pEP-Kan-S質粒模板上Kan抗性基因的DNA片段，產物經膠回收后電轉化至制備的pDEV-EF1/GS1783感受態細胞，振蕩培養后涂布含氯霉素(CAM)和Kan的LB平板。挑取陽性克隆提取質粒，酶切和PCR篩選正確重組的克隆(pDEV-ΔVP26-Kan)進行第二次重組。第二步Red重組將pDEV-ΔVP26-Kan質粒中的Kan抗性基因刪除。即接種pDEV-ΔVP26-Kan菌落于CAM抗性LB液體培養基中，待菌液出現輕微云霧狀時加入等量2%L-阿拉伯糖(L-Ara)，培養1 h后轉入42℃水浴搖床培養20 min，最后32℃培養1 h，將細菌懸液稀釋后涂布于含1%L-Ara和CAM抗性平板進行培養，挑取菌落同時點種于CAM和Kan平板。酶切和PCR鑒定CAM陽性和Kan陰性的菌落，篩選獲得陽性克隆pDEV-ΔVP26。
表1用于缺失DEV VP26(UL35)的引物
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