脂肽對蜜蜂球囊菌生長抑制作用及其孢子萌發(fā)的影響（三）
2.2體外抑菌試驗結果
2.2.1抑菌圈試驗
由圖3可知，Iturin和Fengycin對蜜蜂球囊菌有抑制作用,Iturin的抑制作用最強,抑菌圈半徑達8.53 mm,其次是Fengycin,抑菌圈半徑為5.84mm,Surfactin對蜜蜂球囊菌無抑制作用。Iturin抑菌效果最好，選其進行后續(xù)試驗。
2.2.2 MIC和MFC測定
由圖4可知，Iturin濃度為0.2~3.13μg/mL時，蜜蜂球囊菌D???nm值較高;Iturin濃度為3.13~25μg/mL時,D???nm值持續(xù)變低;當Iturin濃度>25μg/mL時，達到最大抑菌效果。累積分布率統計表明，Iturin濃度為3.13μg/mL時，可抑制2株菌株(累積分布率2/55);濃度升至6.25μg/mL時，抑菌范圍擴大至26株，使累積抑菌株數達28株(累積分布率28/55),確定Iturin對蜜蜂球囊菌的MIC??值為6.25μg/mL。Iturin濃度為25μg/mL時，所有受試菌株均被抑制(累積分布率55/55)，確定Iturin對蜜蜂球囊菌的MIC??值為25μg/mL(表2)。
MFC試驗中陰性對照沒有蜜蜂球囊菌生長，陽性對照蜜蜂球囊菌全部生長，Iturin濃度為6.25、12.5、25μg/mL時蜜蜂球囊菌生長，Iturin濃度為50、100μg/mL時無蜜蜂球囊菌生長，Iturin對蜜蜂球囊菌的MFC是50μg/mL(表3)。
表2 Iturin對蜜蜂球囊菌的MIC
表3 Iturin對蜜蜂球囊菌的MFC
2.3抑菌機制探究
2.3.1 Iturin對蜜蜂球囊菌孢子的影響
由圖5可知,與對照組相比,Iturin各濃度組蜜蜂球囊菌孢子萌發(fā)率均顯著下降(P<0.05)。PI染色結果顯示,對照組中孢子幾乎未被染色;隨著Iturin濃度增大,被PI染色的孢子(紅色熒光斑點)數量逐漸上升,當Iturin濃度為50μg/mL時,大量孢子被染色,呈現出強烈的紅色熒光反應(圖6)。
2.3.2 Iturin對蜜蜂球囊菌細胞膜的影響
由圖7可知,隨著Iturin濃度的升高,麥角甾甾醇含量逐漸降低。與對照組相比，當Iturin濃度為12.5、25和50μg/mL時,麥角甾甾醇含量分別下降了52.18%、60.69%和67.12%,差異顯著(P<0.05)。
2.3.3 Iturin對蜜蜂球囊菌細胞壁的影響
由圖8可知,與對照組相比,Iturin各濃度處理組幾丁質含量分別下降了17.39%、22.58%、30.69%和32.94%,25和50μg/mL Iturin組幾丁質含量顯著低于對照組(P<0.05)。
3討論
本研究通過形態(tài)學與分子生物學方法對分離菌株進行了鑒定。結果顯示，分離菌株在PDA培養(yǎng)基上形成典型的白色絨毛狀菌落，顯微觀察可見具有隔膜的分枝狀菌絲結構。其孢子呈橢圓形，大小為(2.8~2.9)μm×(1.4~1.5)μm,孢子囊直徑為69~80μm,與余林生等報道的蜜蜂球囊菌特征一致。經分子生物學鑒定顯示，菌株18S rDNA PCR擴增獲得大小約600bp的特異性條帶，與戚偉等研究中報道的一致。測序結果與GenBank數據庫中蜜蜂球囊菌(登錄號:GQ867785.1)相似性達100%。該綜合鑒定方法確保了菌株鑒定的準確性。
抑菌試驗結果顯示，Iturin抑菌效果呈現明顯的濃度依賴性，3.13~25μg/mL范圍內抑菌作用逐漸增強，25μg/mL時達到最大效果。孢子萌發(fā)抑制試驗證實其抑制率與濃度呈正相關(6.25~50μg/mL)。相比對其他病原菌的MIC值(鐮刀霉51.8μg/mL,灰葡萄孢霉37.0μg/mL),Iturin對蜜蜂球囊菌顯示出更強的抑制活性，表明其具有高效、廣譜的抗真菌特性。
麥角甾甾醇作為真菌細胞膜的重要組成成分，在維持細胞膜的流動性、通透性和穩(wěn)定性等方面具有重要作用。本研究發(fā)現，Iturin處理可顯著降低蜜蜂球囊菌細胞膜麥角甾甾醇含量。試驗結果顯示，當Iturin濃度≥12.5μg/mL時，麥角甾甾醇含量較對照組下降52.18%~67.12%，表明Iturin可能干擾真菌細胞膜的生物合成。現有研究表明，Iturin的膜破壞作用具有多靶點特征。首先，抑制NADPH氧化酶誘導氧化應激;其次，激活鉀通道致K?失衡，上述機制與本研究中觀察到的麥角甾甾醇含量降低現象具有潛在關聯性。此外，還可直接破壞磷脂雙分子層結構，這一觀點與本研究中檢測到的膜通透性改變結果相呼應。這些機制導致細胞膜狀態(tài)發(fā)生改變，最終引發(fā)細胞凋亡。
幾丁質作為真菌細胞壁的主要結構成分，在維持細胞形態(tài)和機械強度方面起著關鍵作用。本研究發(fā)現，Iturin處理可顯著影響蜜蜂球囊菌細胞壁幾丁質的含量，表明Iturin能有效干擾細胞壁結構。基于本試驗結果，結合現有文獻報道，推測Iturin可能通過以下機制影響細胞壁合成:幾丁質含量的顯著降低提示Iturin可能干擾了幾丁質合成酶的活性;細胞壁機械強度的下降表明β-1,3-葡聚糖的合成可能也受到抑制;細胞壁合成相關基因的表達調控可能受到影響，MAPK信號通路調控機制為此提供了可能的解釋路徑。故Iturin可通過多重分子機制破壞細胞壁穩(wěn)態(tài)，最終導致細胞壁結構缺陷和機械強度下降。這種多靶點作用模式使真菌細胞難以維持正常形態(tài)和滲透壓平衡，進而抑制菌絲生長和孢子萌發(fā)等關鍵生理過程，最終引發(fā)細胞凋亡。
綜上所述，本研究揭示了Iturin對蜜蜂球囊菌的抑菌活性及其機制，為新型抗真菌劑的研發(fā)提供了重要理論依據。這些研究成果不僅拓展了Iturin對蜜蜂球囊菌抑菌機制的深入了解，更為蜜蜂球囊菌病害防控開辟了新的技術方向。在農業(yè)生產實踐中,Iturin有望成為保障蜜蜂健康、維護生態(tài)平衡的重要技術手段，對促進蜂業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要的理論意義和應用價值。未來研究可進一步結合體內試驗和田間應用,深入評估其實際應用效果,加速推進相關技術的產業(yè)化進程。
4結論
本研究從患白堊堊病蜜蜂幼蟲中成功分離純化蜜蜂球囊菌，脂肽Fengycin和Iturin可抑制蜜蜂球囊菌菌絲生長，Iturin作用效果最好，Surfactin無抑制作用。Iturin在48h對蜜蜂球囊菌的MIC??、MIC??和MFC分別為6.25、25和50μg/mL。Iturin可有效抑制菌絲生長、蜜蜂球囊菌孢子萌發(fā)，并破壞細胞膜和細胞壁。
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