小龍蝦貯藏過程中優勢腐敗菌篩選、及微生物菌群結構分析（一）
摘要：以4℃貯藏小龍蝦貨架期終點篩選武漢孝感小龍蝦中優勢腐敗菌，同時結合高通量測序方法，進一步確定小龍蝦中優勢腐敗菌，并對小龍蝦貯藏過程中菌相變化、微生物結構及其多樣性進行分析。結果表明：傳統培養法從腐敗小龍蝦中共篩選出10株腐敗菌，包括波羅的海希瓦氏菌（Shewanella baltica）、維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii）、普通變形桿菌（Proteus vulgaris）等；在屬水平上，高通量測序法最終確定氣單胞菌屬（Aeromonas sp.）及希瓦氏菌屬（Shewanella sp.）是小龍蝦腐敗末期相對豐度最大的2種優勢腐敗菌；同時，高通量測序結果表明，隨著貯藏時間的延長，小龍蝦微生物群落豐富度、多樣性及均勻度不斷下降，這與腐敗末期優勢腐敗菌的大量增長及生長繁殖過程中抑制其他種類微生物有關。
小龍蝦，也稱克氏原螯蝦（Procambarus clarkii），屬于淡水經濟蝦類，原產于北美洲地區，19世紀30年代引入我國。因其風味獨特、肉質鮮美，同時具有高蛋白、低熱量的特性，受到廣大消費者的喜愛，成為人們餐桌上常見的美食。水產品由于營養豐富且水分含量較高而容易引起細菌的增殖進而腐敗，難以保存。而小龍蝦好溫喜濕，常見于淤泥等復雜生長環境，因此其本身攜帶的微生物種類和數量更多。同時，小龍蝦含有大量的自由氨基酸及內源氧化酶，因此相較于其他水產品而言，更容易遭到微生物的侵襲，這些都在一定程度上影響了小龍蝦產業的發展。
大量研究發現，在水產品腐敗過程中部分種類細菌的數量逐漸上升并占據絕對優勢地位，對水產品的腐敗變質起著主導作用，這些細菌被稱為優勢腐敗菌，其為水產品品質下降最重要的原因。不同水產品的優勢腐敗菌種類會存在一些差異，于淑池等發現，冷藏卵形鯧鲹中優勢腐敗菌為希瓦氏菌及假單胞菌，Leroi等在4℃冷藏生鮭魚中發現其優勢腐敗菌主要為假單胞菌，南美白對蝦中主要腐敗菌則為不動桿菌、希瓦氏菌，而淡水水產品，如鰱魚和草魚中的優勢腐敗菌主要為氣單胞菌和假單胞菌。對于水產品中優勢腐敗菌的篩選和鑒定，在早期的研究中一般都是利用傳統培養法進行。隨著分子生物學的進步與發展，目前研究中廣泛利用傳統培養法結合高通量測序法對優勢腐敗菌進行篩選和鑒定。同時，高通量測序方法還可以對貯藏過程中水產品的微生物結構組成及其多樣性進行分析，目前已在帶魚、牡蠣等水產品中成功應用，明確了微生物在產品貯藏過程中的變化趨勢。
本研究篩選和鑒定武漢孝感小龍蝦4℃貯藏過程中的優勢腐敗菌，并對小龍蝦貯藏過程中菌相變化以及微生物菌群結構及其多樣性進行分析。優勢腐敗菌是水產品品質的關鍵控制點，與水產品貨架期密切相關，因此開展對小龍蝦中優勢腐敗菌的研究與篩選鑒定，有利于下一步利用殺菌保鮮技術靶向殺滅優勢腐敗菌，提高保鮮效果，延長小龍蝦貨架期。
1材料與方法
1.1材料與試劑
小龍蝦來源于武漢孝感，經加冰保活運送至實驗室備用，進行實驗操作前加冰猝死。
氯化鈉、硼酸、氧化鎂、鹽酸國藥集團化學試劑有限公司；營養瓊脂（nutrient agar，NA）、假單胞菌選擇性瓊脂（Pseudomonas CFC selective agar，CFC）培養基、三糖鐵瓊脂（triple sugar iron agar，TSI）培養基、BP（Baird-Parker）培養基、氣單胞菌基礎（Aeromonas medium base，RYAN）培養基青島海博生物技術有限公司。
1.2儀器與設備
凱氏定氮儀；電子天平；TS-2402CL恒溫振蕩器；恒溫培養箱；GI80TW全自動高壓滅菌器。
1.3方法
1.3.1小龍蝦貯藏期間菌落總數的測定
采用活菌平板計數法，測定小龍蝦中總需氧菌菌落總數，測定方法參考GB 4789.2—2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗菌落總數測定》。稱取10 g蝦肉，加入90 mL無菌生理鹽水，在無菌條件下勻漿，制成10 g/100 mL樣品均質液。之后用生理鹽水進行10倍梯度稀釋。取稀釋后的樣品100μL涂布于NA平板上，于30℃恒溫培養箱中培養36～48 h，選取合適的平板進行菌落計數，單位為lg（CFU/g）。
1.3.2小龍蝦貯藏期間總揮發性鹽基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量的測定
每隔2 d測定小龍蝦中TVB-N含量，測定方法參照GB 5009.228—2016《食品安全國家標準食品中揮發性鹽基氮的測定》中的方法二自動凱氏定氮儀法。準確稱取2 g蝦肉糜于蒸餾管中，之后加入75 mL純水，振蕩使樣品均勻分散，并在水中浸漬30 min。測定前加入1 g MgO，將蒸餾管連接至自動凱氏定氮儀。以20 g/L硼酸為接收液，0.01 mol/L鹽酸為滴定液，1 g/L甲基紅-乙醇溶液和1 g/L溴甲酚綠-乙醇溶液以體積比1:5混合作為混合指示劑。