小龍蝦貯藏過程中優勢腐敗菌篩選、及微生物菌群結構分析（二）
1.3.3腐敗菌單菌落的分離及純化
將鮮活小龍蝦碎冰猝死后，置于4℃條件下貯藏，選擇貯藏腐敗終點的小龍蝦樣品按照1.3.1節中的方法制成菌懸液，進行10倍梯度稀釋，選擇合適稀釋倍數菌液均勻涂布于NA、CFC培養基、TSI培養基、BP培養基、RYAN培養基，置于30℃恒溫培養箱中孵育48 h，在選擇性培養基上挑選不同顏色、形態的菌落，挑取單菌落并進行2～3次劃線純化，并于-80℃保存。
1.3.4腐敗菌菌種的鑒定
1.3.4.1分子生物學鑒定及系統發育樹的構建
腐敗菌接種于營養肉湯培養基中孵育至對數穩定期，提取細菌DNA并進行16S rDNA的聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增，最終產物送往北京擎科生物科技有限公司進行測序。將測序結果在美國國家生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）與Gen Bank庫中進行BLAST序列比對。選取相似性在98%以上的菌株序列，利用MEGA 7.0.26軟件中的鄰近法（Neighbor-Joining）構建系統發育樹。
1.3.4.2生理生化實驗鑒定
根據《伯杰氏細菌鑒定手冊》等，應用一系列生理生化實驗，將篩選得到的腐敗菌菌種作進一步鑒定。
1.3.5高通量測序法測定小龍蝦中優勢腐敗菌
選取在4℃貯藏0 d（鮮樣期）、8 d（腐敗初期）、12 d（腐敗中期）、16 d（腐敗末期）的小龍蝦，取蝦肉進行制樣，得到菌懸液。提取樣品菌懸液的DNA，并進行PCR擴增，將檢測合格后的DNA樣品送至上海凌恩生物科技有限公司進行高通量測序。
1.4數據處理
每組實驗設置3次平行，結果用平均值±標準差表示。利用SPSS 17.0軟件對數據進行差異顯著性分析，差異顯著性標準為P＜0.05，采用Origin 7.5軟件作圖。
2結果與分析
2.1小龍蝦4℃貯藏期間菌落總數及TVB-N含量變化
圖1 4℃貯藏期間小龍蝦菌落總數的變化
小寫字母不同，表示差異顯著（P＜0.05）。下同。
水產品及肉類食物容易在微生物及酶的作用下發生蛋白質分解、脂質氧化等生化反應，進而引起腐敗變質。因此可以通過測定小龍蝦肉中的菌落總數來初步判斷小龍蝦被細菌污染及腐敗的程度，反映蝦的品質。由圖1可知，小龍蝦在4℃貯藏過程中的菌落總數隨著時間的延長呈現上升的趨勢，貯藏0～2 d，其增長趨勢比較緩慢，說明小龍蝦并沒有發生明顯的腐敗。而貯藏2～10 d，菌落總數急劇增加，說明小龍蝦在這個過程中發生嚴重腐敗。貯藏6 d左右，小龍蝦菌落總數超過無公害水產品安全限值（6.0（lg（CFU/g））），表明此時小龍蝦腐敗嚴重，到達了其貨架期的終點。江楊陽等對江蘇盱眙產地小龍蝦研究發現，菌落總數也在6 d超過6.0（lg（CFU/g））。除此之外，Li Yan等發現，南美白對蝦同樣在貯藏6 d菌落總數超過了限值。本實驗中的小龍蝦在貯藏10 d之后，菌落總數不再明顯增長，逐漸進入穩定期。
圖2 4℃貯藏期間小龍蝦TVB-N含量的變化
TVB-N是在微生物和酶的雙重作用下分解蛋白質等含氮物質產生的生物胺、氨等揮發性堿性代謝物質的總稱，其含量是評價水產品及肉類品質最重要的指標，是判斷水產品新鮮程度及是否腐敗變質的重要因素。由圖2可知，在整個貯藏過程中，TVB-N含量整體呈現上升趨勢，前期增長比較緩慢，在貯藏后期隨著菌落總數的快速增長、腐敗加劇，導致了TVB-N含量增加速率加快。小龍蝦TVB-N含量在貯藏6 d時已達43.28 mg/100 g，與秦求思等測得的4℃貯藏6 d的鷹爪蝦TVB-N含量相近，超過GB 10136—2015《食品安全國家標準動物性水產制品》中所規定的淡水水產品TVB-N含量限定值30 mg/100 g，并且伴隨強烈的動物腐爛的氨臭味。這與小龍蝦菌落總數超過限值的貯藏時間相一致，表明TVB-N含量變化與菌落總數密切相關，結合2個指標結果綜合分析得出，小龍蝦在貯藏6 d時已經腐敗。
2.2優勢腐敗菌單菌落的分離
選擇在4℃貯藏至腐敗的小龍蝦進行平板涂布、劃線，根據菌落形態及顏色差異在5種固體培養基上分離純化出10株細菌，編號依次為B1～B10。10株細菌菌落形態及顏色具體見表1。
表1所篩選腐敗菌菌落的形態特征
2.3腐敗菌菌種的鑒定
2.3.1腐敗菌菌株分子生物學鑒定
對菌株B1～B10進行16S rDNA測序后，登錄NCBI網站進行BLAST序列比對，并選取Max ident在98%以上的菌株，構建系統發育樹，根據系統發育樹（圖3）及測序對比結果，將B5、B6、B7、B9及B10細菌定種，分別為中間氣單胞菌（Aeromonas media）、巨型球菌（Macrococcus caseolyticus）、解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）、蜂房哈夫尼亞菌（Hafnia alvei）及缺陷短波單胞菌（Brevundimonas diminuta）。
圖3基于16S rDNA構建的系統發育樹
2.3.2生理生化實驗鑒定
根據測序結果及系統發育樹已對部分菌株定種，對仍無法定種的幾種腐敗菌進行生理生化實驗，結果如表2所示，最終確定菌株B1～B4及B8的種類，分別為普通變形桿菌（Proteus vulgaris）、波羅的海希瓦氏菌（Shewanella baltica）、弗氏檸檬酸桿菌（Citrobacter freundii）、維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii）和嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）。
表2部分菌株生化鑒定實驗結果
注：-.陰性；+.陽性；/.未進行實驗。
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