鼠李糖乳桿菌生長曲線、溫度誘導對菌體生長速率的影響
鼠李糖乳桿菌(LactobacillusrhamnosusGG，LGG)屬于乳桿菌屬(Lactobacillus)，最適生長溫度37℃，兼性厭氧[1-2]。LGG由兩位美國科學家Sherwood Gorbach和Barry Goldin在上世紀80年代發現，該菌分離自健康人體腸道[3]，大量研究證明LGG能夠定植于腸道，通過調節腸道菌群，起到抵御病原微生物的侵襲等作用，具有預防和治療腹瀉、預防呼吸道感染、預防齲齒、抗過敏的作用，提高機體免疫力等功效[4]，LGG在酸奶、飲料、奶粉、奶酪、保健品等均有應用。
通常，LGG可通過液態發酵生產工藝獲得，進一步通過冷凍干燥的方法獲得菌粉，菌粉是微生物的最佳保存方式，然而冷凍干燥會不可避免的造成乳桿菌細胞膜的損傷，具體的損傷包括:機械損傷、溶質損傷、細胞膜滲透性損傷[5]、蛋白質變性失活、pH平衡的破壞和細胞膜脂肪酸的變化[6-7]。然而，微生物也會通過改變膜的流動性和改變蛋白質的翻譯來適應低溫環境。冷休克蛋白(cold shock proteins，Csps)是微生物為適應低溫環境產生的應激蛋白，大腸桿菌在低溫誘導過程中會產生大量GspA蛋白，可占到細胞總蛋白合成的13%，隨后又發現了8中同源性蛋白:CspB、CspC、CspD、CspE、CspF、CspG、CspH、CspI蛋白[8]。枯草芽孢桿菌在低溫環境下有13個Csps蛋白被誘導產生。在低溫條件下Csps蛋白可以作為RNA的分子伴侶，與mRNA結合，穩定RNA，促進菌體在低溫條件下轉錄并翻譯[9]，其中CspA、CspB、CspG、CspI蛋白在低溫誘導下產生，CspC、CspE蛋白在正常培養條件下產生[10，11]。然而，與CspA蛋白不同的是CspC蛋白的表達量隨溫度的升高而降低，使用基因敲除的方法去除大腸桿菌的cspc基因后，發現菌體的生長明顯加快[12]。說明CspC有抑制菌體生長的作用，因此在生長過程中抑制CspC蛋白的表達可能會有利于提高菌體的生長速率。然而對于LGGcspcmRNA基因的研究還未見報道。
本文通過對LGG進行溫度誘導處理，通過熒光實時定量PCR(RT-PCR)的方法檢測cspc的表達，并且對誘導后的菌體進行生長速率的測定，以考察溫度誘導對cspcmRNA基因表達的影響，以及對菌體生長速率的影響，揭示cspcmRNA基因與生長速率的關系，為提高LGG的產量提供一定的理論依據。
1材料與方法
1.1材料與儀器
鼠李糖乳桿菌(LactobacillusrhamnosusGG，LGG)GD20150520內蒙古醫科大學藥學院生物制藥實驗室;酪蛋白胨、酵母粉、牛肉粉北京奧博星生物技術有限責任公司;葡萄糖、乙酸鈉、檸檬酸三銨、吐溫-80、MgSO4、K2HPO4、瓊脂粉國藥集團化學試劑有限公司;cspc基因引物序列(F:5′-TGATAA GGGTTACGGCTTCA′，R:5′-GGCCACGATCAGATTG TTCTAC-3′)，產物長度140 bp、16S rDNA引物序列(F:5′-TAGCGTACCATCTGATCCAGTA′，R:5′-GAAGTCGTCGCGTTGACA-3′)，產物長度187 bp美國Invitrogen;RNA提取試劑盒(RNAiso PlusD9108A)、cDNA反轉錄試劑盒(PrimeScript RT reagent KitDRR037A)、RT-PCR試劑盒日本Takara。
1.2實驗方法
1.2.1鼠李糖乳桿菌的發酵培養菌種采取四級發酵培養方法，一、二、三級為種子擴大培養基，四級為最終發酵培養基，一級培養基接入0.3 g的凍干菌種，混勻，放置恒溫厭氧培養箱37℃靜置培養16 h。二級培養基由培養好的一級發酵液按4%的接種量接入，培養12 h。以此類推，傳代到四級最終發酵培養基。
1.2.2活菌數的測定采用平板混菌計數法[13]。
1.2.3生長曲線測定四級發酵液按不同的時間點(0、1、2、3、4、6、8、10、12、16、20 h)取樣，測定發酵液活菌數，制作生長曲線。
1.2.4cspcmRNA基因表達量法檢測mRNA的表達量根據GenBank上報道的鼠李糖乳桿菌的cspc基因序列，利用Prime5.0軟件設計RT-PCR法檢測cspc基因的引物。提取鼠李糖乳桿菌總RNA，按試劑盒說明書方法操作，用酶標儀檢測RNA純度，OD260/OD280在1.8～2.0為符合要求的RNA。反轉錄cDNA，按照試劑盒說明操作，RNA上樣量為2.0μL(約500 ng)，反應條件:37℃，15 min;85℃，5 s結束反應，得到cDNA。
熒光定量PCR，按照試劑盒說明書方法操作，以cDNA為模板，加入cspc基因的引物，通過實時熒光實時定量PCR(Real time PCR，RT-PCR)方法擴增cspc基因。反應條件:預變性95℃30 s;變性95℃5 s，退火60℃34 s讀板，共40個循環;從65℃到95℃制作融解曲線。以16s rDNA為內參基因，以確定cspcmRNA基因的相對表達量。產物做電泳檢測分析，膠回收，產物送測序Invitrogen公司，NCBI blast比對分析。
RT-PCR所獲得的數據，利用2-ΔCt(ΔCt=cspc基因Ct值-16S rRNA Ct值)公式進行cspcmRNA基因在LGG中相對表達量計算。
1.2.5溫度誘導cspcmRNA基因表達試驗將鼠李糖乳桿菌四級發酵液分別置于37、39、41、43、45℃的恒溫水浴中分別處理10、15、20、25、30 min，即按照5組(溫度)×5組(時間)設計，共25組試驗，每組試驗設3個重復，37℃為對照組。RT-PCR法檢測cspcmRNA基因的表達量[14]。
1.2.6溫度誘導后菌體的生長速率測定在三級發酵接種到四級培養基培養4 h時，即菌體進入對數生長期后，按1.2.5確定的最佳誘導溫度和時間進行溫度誘導，之后繼續培養4 h再次進行溫度誘導，之后再繼續培養12 h結束發酵。RT-PCR法檢測菌體的cspcmRNA基因表達量，活菌數法測定菌體生長曲線，并計算生長速率，生長速率=(lg活菌數t1-lg活菌數t0)/(t1-t0)(t1、t0表示發酵時間點)，以未進行溫度誘導作為對照[14]。
1.2.7凍干驗證試驗為了考察溫度誘導對鼠李糖乳桿菌凍干存活率的影響，在終止發酵后對菌體進行冷凍干燥[14]。鼠李糖乳桿菌四級發酵誘導組、對照組，發酵液經10000 r/min離心20 min，棄去上清液，保留菌體，加入凍干保護劑(凍干保護劑:25%脫脂奶粉、10%乳糖、10%抗壞血酸)混勻，-40℃預冷30 min，真空干燥36 h得到凍干菌粉。菌粉懸溶于100 mL PBS中混勻，活菌數法測定混懸液的活菌數，計算凍干菌粉總活菌數(凍干菌粉總活菌數=混懸液活菌數濃度×100 mL)。根據發酵液總活菌數(發酵液總活菌數=發酵液活菌數濃度×發酵液體積)，計算凍干存活率。凍干存活率(%)=凍干菌粉總活菌數/發酵液總活菌數×100。
1.3數據處理
每組實驗設3個重復，試驗數據均采用平均值和標準誤差表示，應用Tukey test檢驗進行分析，p<0.05表示差異顯著，p<0.01表示差異極顯著。
2結果與分析
2.1鼠李糖乳桿菌生長曲線
鼠李糖乳桿菌生長曲線如圖1。
圖1鼠李糖乳桿菌生長曲線
如圖1所示，鼠李糖乳桿菌生長良好，0～3 h是菌體的適應期，3～12 h是菌體的對數生長期，12～16 h是菌體的穩定生長期，16 h之后菌體進入衰退期。
2.2鼠李糖乳桿菌cspc基因克隆及電泳驗證
鼠李糖乳桿菌cspc基因克隆電泳結果見圖2。
圖2 cspc基因RT-PCR電泳結果
如圖2所示鼠李糖乳桿菌cspc基因克隆片段，大小為140 bp，產物經電泳、膠回收、測序、比對，確認為cspc目標基因。
2.3溫度誘導對cspc mRNA基因表達的影響
CspC蛋白是CspA蛋白家族中的一個成員，與CspA蛋白不同的是，CspC蛋白不需要低溫誘導表達，在37℃即可表達，研究顯示[15-16]，CspC蛋白與染色體凝集和細胞分裂有關，并且有抗轉錄終止的作用。Shenhar等[17]研究表明，CspC蛋白可以促進細菌脅迫應答因子(RpoS)的表達，RpoS是微生物在環境壓力產生的適應性因子，因此可以說CspC蛋白是微生物對抗環境壓力的重要因子。然而，其具體的生物學功能還不是十分明確。與CspA蛋白不同的是，CspC蛋白的表達量隨溫度的升高而降低，然而對于鼠李糖乳桿菌cspcmRNA基因的研究還未見報道。本研究通過升高溫度抑制LGGcspcmRNA基因的表達，如圖3所示，在對照37℃時，不同的作用時間對其表達量沒有影響，而在溫度高于37℃時，菌體cspcmRNA基因的表達量明顯下調，說明溫度升高可以抑制菌體產生cspcmRNA基因，且在43℃誘導30 min，菌體cspcmRNA基因的表達量最低，且差異極顯著(p<0.01)。
圖3溫度誘導后csps mRNA基因的相對表達量
2.4溫度誘導后菌體的生長速率測定結果
本研究中，通過升高溫度抑制菌體cspcmRNA基因的表達，結果如圖4所示，在接種后生長第4和8 h，菌體經43℃、30 min誘導，菌體cspcmRNA基因的表達明顯降低，而隨著溫度降至37℃，cspcmRNA基因的表達又恢復到原來水平。如圖5所示，經過誘導后的鼠李糖乳桿菌生長明顯加快，且活菌數明顯升高。如圖6所示，經過兩次誘導后，與對照組相比，誘導組4～6 h以及8～10 h的生長速率明顯增高，差異顯著(p<0.05)，而6～8 h和10～12 h兩組的生長速率差異不顯著。
圖4溫度誘導條件下菌體cspc mRNA基因的相對表達量
圖5溫度誘導條件下菌體的生長曲線
圖6溫度誘導條件下菌體4～12 h的生長速率
2.5鼠李糖乳桿菌凍干驗證試驗
如圖7所示，誘導組與對照組相比，其凍干存活率無明顯差異，說明溫度誘導只影響菌體的生長速率，并不影響菌體的凍干存活率。
圖7菌體凍干存活率驗證結果
3結論
本研究對鼠李糖乳桿菌進行不同溫度和時間的誘導處理，考察cspcmRNA基因的表達量，并考察在溫度誘導后菌體的生長速率，結果顯示，經43℃、30 min誘導，菌體cspcmRNA基因的表達明顯降低，且誘導后菌體的生長速率明顯升高，溫度誘導相比基因敲除具有安全的優點，可應用于鼠李糖乳桿菌規模化發酵過程中，以提高菌體的產量。此外，研究顯示，通過兩次溫度誘導，鼠李糖乳桿菌的凍干存活率并未下降，也證明了該方法的可行性。
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