白馬耳組織成纖維細胞體外培養、冷凍前及復蘇后存活率、生長曲線繪制（一）
摘要:本研究以內蒙古烏珠穆沁白馬(Equus caballus)雄性和雌性為實驗材料，利用組織塊貼壁培養法進行耳組織成纖維細胞原代建系，研究耳組織來源的細胞貼壁率、冷凍前及復蘇后存活率、生長曲線，進一步繪制烏珠穆沁白馬成纖維細胞核型圖。實驗結果顯示，雌、雄烏珠穆沁白馬耳組織成纖維細胞經組織貼壁法建系培養，生長為典型的成纖維細胞形態，并呈現“S”型生長曲線特征;細胞冷凍前后存活率存在顯著差異，但仍具有較好的耐受冷凍性;根據染色體核型分析，雌、雄烏珠穆沁白馬耳組織成纖維細胞染色體條數為2n=64，其中31對常染色體，1對性染色體。本研究成功建立了雌、雄烏珠穆沁白馬耳組織成纖維細胞系，并且得到可穩定培養、具有良好遺傳學特性的細胞系，為后續的相關深入研究奠定了基礎。
烏珠穆沁白馬(Equus caballus)，蒙古名為烏珠穆沁查干阿都，是蒙古馬中的優良品系，主要繁殖于內蒙古錫林郭勒盟西烏珠穆沁旗草原上。西烏珠穆沁草原是具有代表性的中國溫帶典型草原，總面積22960km2，是唯一匯集內蒙古九大類型草原的地區，也是中國北方草原最華麗、最壯美的地段，素有“天堂草原”之稱。
我國對于烏珠穆沁白馬的研究主要對不同年齡段的體高、體長、體重等體尺性狀和非遺傳因素、毛色特征、肉品質三方面進行了研究(敖敏2019)。除此之外，對烏珠穆沁白馬馬肉的營養成分測定和奶制品的營養成分的測定、分析以及與其他品種的比較分析(旭仁其木格2018，趙雪妮2021)。目前大量的馬種資源處于數量下降、瀕危或瀕臨滅絕狀態，同時，目前是馬種資源的保種和向非役用轉型的關鍵時期(韓國才2014)，而細胞建系是物種遺傳資源保護的重要途徑，可為未來深入研究奠定基礎。
本研究利用烏珠穆沁白馬雄性和雌性耳組織成纖維細胞體外培養建立烏珠穆沁白馬體細胞系，在此基礎上對建成的體細胞系進行形態、貼壁率、凍存率、生長速度、核型等生物學特性分析，為其保護和開發利用提供參考。
1材料與方法
1.1實驗材料
取雌(32#耳號14798)和雄(18#耳號14250)各一匹烏珠穆沁白馬的耳部組織(材料采集是在不影響動物個體健康狀況的情況下進行的，符合動物倫理)用75%的酒精消毒，裝入含有青霉素-鏈霉素雙抗的無菌生理鹽水的50ml離心管內，帶回實驗室。再用75%的酒精再次消毒組織塊，然后浸泡在無菌生理鹽水中用PBS清洗3次，按照組織貼壁培養方法進行無菌接種培養(劉建等2018)。
1.2實驗方法
1.2.1烏珠穆沁白馬耳組織成纖維細胞原代培養及傳代純化培養
將生理鹽水中保存的烏珠穆沁白馬耳組織塊置于30mm培養皿中用75%的酒精中浸泡30s，再用DPBS緩沖液清洗5次。在30mm培養皿中用眼科鑷鑷夾住組織塊，將其剪成0.5~1mm3的小組織塊，然后均勻地鋪在T25培養瓶(康寧)中，倒置培養瓶并加入含有1%青霉素-鏈霉素雙抗和10%特級胎牛血清(foetal bovine serum，FBS)的MEM-Alpha培養液(gibco賽默飛)5ml，置于37℃、5%CO2培養箱內培養，6~8h后緩慢將T25培養瓶翻轉進行原代建系培養(穆瑤等2019)。
當細胞培養3~4d后，培養液變黃時需要更換新的培養液繼續培養。當原代細胞培養生長至匯合度大于80%時，棄掉培養液，加入2ml DPBS輕輕晃動培養瓶沖洗細胞后棄掉廢液，再加入2ml胰蛋白酶消化液在培養箱中靜置消化細胞2~3min，直至在顯微鏡下觀察細胞形態變成圓形或呈漂浮狀態時，立即加入4ml已預熱的培養液終止消化，反復吹打細胞使貼壁細胞脫落，得到單細胞懸液。由原代細胞直接進行傳代時單細胞懸液中有較多組織塊，需用過濾器將組織塊過濾掉。將單細胞懸液1300 r/min離心3min后棄掉上清，收集細胞沉淀。再加入3ml預熱培養液重懸細胞，將細胞按傳代比例接種于T25培養瓶中，并用培養液補充至每瓶5ml，置于37℃5%CO2培養箱培養24h，觀察細胞生長情況并拍照記錄。
1.2.2烏珠穆沁白馬耳組織成纖維細胞支原體檢測
本實驗使用BI-20-70020支原體檢測試劑盒進行檢測。在細胞生長狀態良好時，取1 ml細胞培養液上清液200r/min離心3~5min收集上清液。將上清液13000r/min離心10 min收集沉淀。用50μl緩沖液重懸沉淀并充分混勻，于95℃干浴器上加熱3min，得到檢測樣本。按照說明書配制PCR體系，包括檢測樣本(H2O29μl;反應混合物10μl;檢測樣本5μl;內控DNA模板1μl;內控引物混合物5μl)、陰性對照(H2O29μl;反應混合物10μl;H2O5μl;內控DNA模板1μl;內控引物混合物5μl)、陽性對照(H2O33μl;反應混合物10μl;內控DNA模板1μl;內控引物混合物5μl;陽性對照DNA模板1μl)。使用40μl礦物油覆蓋反應物，防止蒸發。設置PCR反應參數:預變性94℃30s;變性94℃30s，退火60℃120s，延伸72℃60s，35個循環;循環結束后變性94℃30s，退火60℃120s，延伸72℃5min;反應結束后4℃保存。
使用2%瓊脂糖凝膠電泳對上述PCR產物進行檢測分析，使用凝膠成像儀拍照對比檢測樣本、陽性對照、陰性對照條帶，確定檢測樣本是否存在支原體污染。支原體檢測陽性模板為357bp和270bp兩條帶，其中270bp為支原體污染后顯示的條帶，支原體檢測陰性模板條帶為357bp，如出現樣品出現270bp條帶，則認為存在支原體污染。
相關新聞推薦
1、對蝦養殖池水中葉綠素a濃度和微藻種類優勢度指數及均勻度（下）
3、生防菌株不同生長階段時發酵液色素與OD650 nm的變化