HIF-1α納米抗體對黑素瘤細胞增殖與生長（結果與分析、結論）
2結果與分析
2.1 HIF-1α納米抗體的篩選及序列特征
通過對陽性克隆的序列進行比對，篩選出6個VHH序列。經過ELISA法對6個陽性克隆進行抗原結合力檢測，選取1A12作為候選克隆（表1）。1A12的核苷酸序列與NCBI數據庫中的VHH序列相似性達到78%，通過對1A12克隆的氨基酸序列分析，發現該序列沒有形成跨膜區，為親水性蛋白。1A12的氨基酸序列由88個氨基酸構成，含有完整的4個框架區（FR1～FR4）和3個高度可變抗原結合區即互補決定區（CDR1～CDR3），其中CDR3是抗原特異性識別的區域，含有11個氨基酸。
表1 HIF-1α單克隆ELISA篩選結果
2.2納米抗體表達、純化與結合性檢測
以挑選出的VHH（1A12）序列質粒為模板進行PCR，擴增出大小約為400 bp的VHH片段（圖1-A）。將VHH片段與PMD19-T連接后再連接到pET-28a表達載體上以構建質粒（圖1-B）。
圖2質粒的構建
構建的質粒經原核表達和純化后，用考馬斯亮藍染色以及Western Blot進行鑒定，結果發現，考馬斯亮藍染色得到的條帶較單一；Western Blot檢測發現大小約為16 ku的特異性條帶，說明該蛋白為表達所得的特異蛋白。
選取小鼠腦組織，免疫組織化學一抗試驗組用HIF-1α納米抗體，用PBS作對照，可看出大腦組織中的免疫陽性信號，由此可見，HIF-1α納米抗體可以與抗原HIF-1α結合，用于HIF-1α的組織定位。
Western Blot試驗中一抗用純化所得的HIF-1α納米抗體，選取小鼠腦組織提取蛋白，結果顯示，HIF-1α納米抗體作為一抗可以與抗原HIF-1α結合，檢測到特異性的免疫陽性條帶，分子質量約為100、120、130 ku，說明腦組織中表達HIF-1α。由此可知，制備的HIF-1α納米抗體可用于Western Blot試驗的一抗以檢測組織中HIF-1α抗原表達的相對定量。
2.3 HIF-1α納米抗體對黑色素瘤細胞增殖、遷移及其相關蛋白表達的影響
將HIF-1α納米抗體加入B16細胞培養基中，用CCK-8法檢測并觀察對B16細胞增殖的影響，結果顯示，在HIF-1α納米抗體作用下，在3～9 h內，加入HIF-1α納米抗體的B16細胞表現出了抑制效果（圖2-A）。將HIF-1α納米抗體加入B16細胞培養基中，用細胞劃痕試驗檢測HIF-1α納米抗體對B16細胞遷移的影響。B16細胞在培養0、12、24、36 h檢測，在12 h時已出現抑制細胞遷移現象（圖2-B）。
圖4 HIF-1α納米抗體對B16細胞增殖、遷移及其相關蛋白表達的影響
在CCK-8法檢測HIF-1α納米抗體抑制B16細胞增殖的基礎上，提取HIF-1α納米抗體處理15 h后的B16細胞總蛋白，用Western Blot檢測VEGF、RAS、ERK、RAC和RAF蛋白的表達量，與對照組相比，HIF-1α納米抗體處理B16細胞后其蛋白量均呈下降趨勢（圖2-C、D）。
3結論與討論
HIF-1α亞基是堿性-環-螺旋（basic-helixloop-helix,Bhlh）–PAS（per/ARNT/Sim，PAS）)超家族成員之一[21]，HIF-1α位于多種致癌和抑癌途徑的交匯點，包括PI3K/AKT和MAPK/ERK信號通路，而這些信號通路是分子信號網絡的核心，控制著許多細胞的生長、增殖、分化和生存，而腫瘤組織常高表達HIF-1α[22-23]。通過多種方式抑制HIF-1α的表達有望成為治療黑色素瘤的方法。
本研究通過已建立的羊駝源黑素瘤噬菌體文庫，以HIF-1α多肽進行4輪淘篩，篩選出1株陽性單克隆菌株，經過原核表達載體構建并誘導表達目的蛋白，鎳柱純化得到HIF-1α納米抗體。所得的納米抗體抗原特異性識別區域CDR3含有11個氨基酸殘基超過了傳統抗體CDR3的平均長度（7～9個氨基酸殘基），可增大與抗原的接觸面積，因此其與抗原具有較好的親和性。VEGF家族是一類血管調節因子[24]，新生血管生成是腫瘤轉移的潛在機制之一，血管參與加速腫瘤生長、促進腫瘤轉移等過程[25]。在黑素瘤細胞中，HIF-1α納米抗體穿過細胞膜進入胞質中，與HIF-1α結合后，抑制VEGF下游靶基因表達，并抑制Ras信號路徑中關鍵基因的表達，同時使黑素瘤細胞中ERK和P-ERK表達下調，ERK是絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinases，MAPK）家族成員之一，該酶被激活后，成為磷酸化的ERK（P-ERK）。p-ERK可以介導信號由胞漿向胞核傳遞，參與調節細胞的生長、發育、分化、分裂等多種生理過程，其異常表達在細胞的惡性轉化和腫瘤的發生發展中起重要作用[26]。并且發現HIF-1α納米抗體在黑素瘤細胞中引起RAF1表達下調，通過PLC-γ-PKC-Raf-MEKMAPK信號通路使細胞增殖和遷移速度下降[27]。此外，在腫瘤組織中，由于新生血管管壁僅有1層內皮細胞，缺乏基底膜，內皮細胞間常有裂隙，同時VEGF本身可提高血管通透性，并刺激內皮細胞釋放膠原酶使腫瘤細胞與腫瘤組織分離脫落，為腫瘤的轉移創造了條件[28]。因此，HIF-1α納米抗體在黑素瘤組織中可能會通過抑制血管形成而成為抑制腫瘤生長和發展的新材料。
本研究獲得的HIF-1α納米抗體分子質量約為16 ku，沒有跨膜結構，具有親水性。HIF-1α納米抗體在構建原核表達載體時加入了His標簽，將HIF-1α納米抗體作為Western Blot和免疫組織化學技術中的一抗，與組織細胞中的HIF-1α特異性結合，使用HRP-His-tag抗體作為二抗，來檢測HIF-1α在組織中的含量及分布。將自備的HIF-1α納米抗體作用于B16細胞時，HIF-1α納米抗體與HIF-1α結合，直接影響下游靶基因VEGF，并引發該信號通路的下調，抑制B16細胞的增殖和遷移，揭示其可能在黑色素瘤增殖、侵襲和轉移中發揮著較為重要的作用，可作為基因治療黑色素瘤的靶點。
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