不同濃度的檸檬酸鈉對脫氮假單胞桿菌發酵過程的影響——材料與方法
1、材料與方法
1.1材料與儀器
1.1.1菌種脫氮假單胞桿菌(Pseudomonasdenitrificans)，由本實驗室保存。
1.1.2藥品和儀器乙酰輔酶A、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、醛縮酶、磷酸丙糖異構酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶和L-乳酸脫氫酶均為Sigma產品，DNA酶、草酰乙酸、磷酸烯醇丙酮酸、ATP、ADP、NADP、NADH、NADPH均為進口分裝生化試劑，其他試劑均為國產分析純。
UV765型紫外-可見分光光度計；ZHWY-2112型大振幅恒溫雙層搖床；高效液相色譜儀SPD-20A(MODEL)；雷磁pHS-3C pH計。
1.2培養基
1.2.1斜面培養基蔗糖30 g，蛋白胨10 g，玉米漿10 g，(NH4)2SO40.25 g，(NH4)2HPO41.5 g，MnSO4·H2O 0.1 g，ZnSO4·7H2O 0.1 g，瓊脂20 g，去離子水1 000 mL。滅菌前調pH至7.0～7.2。
1.2.2種子培養基蔗糖35 g，蛋白胨20 g，KH2PO45 g，(NH4)2SO42.0 g，(NH4)2HPO40.8 g，MgSO41.5 g，ZnSO4·7H2O 0.02 g，MnSO4·H2O 0.2 g，去離子水1 000 mL。滅菌前調pH至7.2～7.4。
1.2.3發酵培養基蔗糖50 g，蛋白胨25 g，(NH4)2SO41 g，ZnSO4·7H2O 0.08 g，MgSO42 g，KH2PO40.8 g，甜菜堿10 g，5，6-二甲基苯并咪唑(DMBI)0.08 g，CoCl2·6H2O 0.15 g，CaCO32 g，去離子水1 000 mL。滅菌前調pH至7.2～7.4。
1.3搖瓶發酵方法
種子液的制備：每支培養好的脫氮假單胞桿菌新鮮斜面(18 mm×180 mm)加入10 mL無菌水，刮洗制備成菌懸液。以無菌吸管吸取2 mL菌懸液至裝有種子培養基的三角瓶(裝量為50 mL/250 mL三角瓶)中，在搖床上進行種子液的培養，培養條件為：溫度30℃；轉速180 r/min；培養至OD700為9～10(周期大概24 h)。
搖瓶發酵：培養好的種子液按10%接種量接種到裝有發酵培養基的搖瓶(裝量為40 mL/250 mL三角瓶)中，在30℃的溫度和180 r/min的轉速下培養。
將檸檬酸鈉按照相應的濃度梯度(濃度梯度為0%、0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%)添加到發酵培養基中，進行搖瓶發酵培養。
1.4酶液的制備
取5 mL發酵液于4℃，4 000 r/min離心20 min，沉淀用5 mL磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.0)充分混勻后在上述相同條件下離心，棄上清繼續用PBS清洗再離心。上述處理后的沉淀中加入5 mL PBS，DNA酶(2.5 mg/mL)25μL，溶菌酶(25 mg/mL)300μL，充分混勻在30℃水浴振蕩30 min，于4℃8 000 r/min離心20 min，上清即為細胞裂解液。
1.5測定方法
1.5.1菌體生物量的測定
將取樣的發酵液進行適當的稀釋后，于700 nm處測定吸光值，用蒸餾水作為對照，試驗設3次重復。菌體的光密度(OD700)=OD讀數×稀釋倍數。
1.5.2維生素B12含量的測定
取30 mL充分搖勻的發酵液于4 000 r/min離心10 min，去上清后加30 mL蒸餾水攪勻在上述相同條件下離心，倒去上清液后加入10 mL蒸餾水將菌體攪勻，加入8%(質量比)亞硝酸鈉溶液和冰乙酸各3 mL，搖勻，于95～100℃水浴30 min；水浴后冷卻至室溫，加蒸餾水定容至50 mL，過濾。所得濾液適當稀釋后，在波長為361 nm處進行紫外光譜分析，根據所繪制的標準曲線算出維生素B12含量，試驗設3次重復。
1.5.3酶液中蛋白的測定酶液中蛋白的測定采用考馬斯亮藍法。
1.5.4酶活的測定
(1)葡萄糖激酶：采用6-磷酸葡萄糖脫氫酶偶聯比色法，1 mL反應體積中含有50 mmol/L Tris-HCl(pH 7.5)，1 mmol/L ATP，0.5 mmol/L NADP，10 mmol/L MgCl2，10 mmol/L葡萄糖和0.7U葡萄糖-6-磷酸脫氫酶。
(2)丙酮酸激酶：1 mL反應體積中含有2 mmol/L磷酸烯醇式丙酮酸，5 mmol/L ADP，2 mmol/L果糖-1，6-二磷酸，0.15 mmol/L NADH，80 mmol/L KCl，10 mmol/L MgCl2和2.85 U L-乳酸脫氫酶。
(3)葡萄糖-6-磷酸脫氫酶：1 mL反應體積中含有2 mmol/L葡萄糖-6-磷酸，1 mmol/L NADP和10 mmol/L MgCl2。
(4)磷酸果糖激酶：采用酶偶聯法，1 mL反應體積中含有2 mmol/L果糖-6-磷酸，1 mmol/L ATP，0.3 mmol/L NADH，10 mmol/L MgCl2，1 U醛縮酶，3.5 U磷酸丙糖異構酶和1 U甘油醛-3-磷酸脫氫酶。
(5)檸檬酸合成酶：1 mL反應體積中含有1 mmol/L 2-硝基苯甲酸(DTNB)，0.5 mmol/L乙酰輔酶A，10 mmol/L草酰乙酸和10 mmol/L MgCl2。
葡萄糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的酶活測定時，1 mL反應體系和50μL細胞裂解液分別在30℃水浴鍋中預熱5 min，混合后立即連續測定340 nm處吸光值10 min，△A值=反應10 minA340值-反應0 minA340值，根據所繪制的NADPH標準曲線算出酶量。
丙酮酸激酶和磷酸果糖激酶的酶活測定時，1 mL反應體系和50μL細胞裂解液分別在30℃水浴鍋中預熱5 min，混合后立即連續測定340 nm處吸光值10 min，△A值=反應0 minA340值-反應10 minA340值，根據所繪制的NADH標準曲線算出酶量。
檸檬酸合成酶的酶活測定時，1 mL反應體系和50μL細胞裂解液分別在30℃水浴鍋中預熱5 min，混合后立即連續測定412 nm處吸光值10 min，△A值=反應10 minA340值-反應0 minA340值，根據公式A=εbc算出酶量，摩爾吸光系數ε=1 485 L/(mol·cm)。
一個酶活力單位(U)定義為在30℃下，1分鐘催化1μmol的底物反應所需的酶量。根據各樣品的蛋白質含量，計算出酶的比活力(比活力代表的是添加檸檬酸鈉與不添加檸檬酸鈉對照酶活下的比值)。
1.5.5有機酸的測定采用HPLC法，色譜條件：色譜柱Hi-Plex H(8μm，300 mm×7.8 mm)，流動相0.01 M H2SO4，流速0.4 mL/min，樣品量10μL，溫度50℃，檢測器UV 210 nm。標準品為檸檬酸、延胡索酸、乙酸、丙酮酸、蘋果酸、琥珀酸、草酰乙酸、α-酮戊二酸和丙酸。
不同濃度的檸檬酸鈉對脫氮假單胞桿菌發酵過程的影響——摘要、結論與討論
不同濃度的檸檬酸鈉對脫氮假單胞桿菌發酵過程的影響——材料與方法
不同濃度的檸檬酸鈉對脫氮假單胞桿菌發酵過程的影響——結果與分析