柑桔砂皮病菌座殼菌生長條件及納米藥劑篩選（二）
2結果與分析
2.1病原菌分離與鑒定
2.1.1形態學鑒定從采集病樣中,分離和純化培養獲得3個分離物,分別接種于PDA上24℃培養,觀察病菌形態特征和分生孢子。其中,S2菌株的菌落白色,有花瓣狀輪紋,氣生菌絲與培養基上菌絲較為發達,未產生分生孢子。應用菌餅接種法接種分離菌株于刺傷柑桔果實上,S2菌株可產生明顯的砂皮病癥狀,且從發病組織上再分離得到的菌與接種菌相同(見圖1)。
圖1柑桔砂皮病葉分離所得S2菌株在PDA培養基上的菌絲形態及菌落形態
2.1.2分子鑒定利用rDNA-ITS序列在NCBI數據庫進行同源性比對,結果顯示S2菌株與Diaporthecitriasiana(KJ490616.1、MN816406.1)的同源性為100%。系統進化分析結果顯示,S2菌株與Diaporthecitriasiana(亞洲柑桔間座殼)聚類到一起,形成明顯分支(圖2)。
綜合菌株的培養性狀、形態特征和rDNA-ITS序列比對結果,將S2菌株鑒定為Diaporthecitriasiana。
2.2病菌生物學特性
2.2.1培養基的影響試驗結果看出,S2菌株在4種供試培養基上均能生長,但菌絲形態和擴展速度存在差異。在OA上,菌落白色,邊緣棉絮狀,無輪紋,菌絲稀薄,菌絲擴展速度最快,培養7 d,菌落直徑達到55.50 mm。在CA上,菌落灰色,邊緣白色、棉絮狀,具花瓣狀輪紋,菌絲旺盛,菌絲擴展速度最慢,培養7 d菌落直徑為44.05 mm。在PDA上,菌落白色,邊緣規則,具花瓣狀輪紋,菌絲旺盛,培養7 d菌落直徑54.80 mm。在PSA上,菌落中心棕色,邊緣棉絮狀,無輪紋,菌絲稀薄,培養7 d菌落直徑52.33 mm(見圖3)。
圖2柑桔砂皮病葉分離所得S2菌株在不同培養基上培養7 d的菌落形態
2.2.2碳源的影響在不同碳源Czapek培養基上,S2菌株均能生長,但菌落形態和菌絲擴展速率存在差異。碳源為可溶性淀粉時培養10 d的菌落直徑63.50 mm,碳源為蔗糖處理時培養10 d的菌落直徑僅44.75 mm,兩者差異顯著(見圖4)。
圖4柑桔砂皮病葉分離所得S2菌株在不同碳源Czapek培養基上培養10 d的菌落形態
2.2.3氮源的影響在不同氮源Czapek培養基上,S2菌株均能生長,但菌絲擴展速率存在差異。氮源為蛋白胨時培養10 d的菌落直徑達到70.40 mm,氮源為氯化銨時培養10 d的菌落直徑僅33.3 mm,兩者差異顯著(見圖5)。
注:賴氨酸氮源處理培養基呈黃色,未接種菌株前即呈黃色。
2.2.4光照的影響不同光照條件下,S2菌株菌絲擴展速率存在差異。在全光照條件下,菌絲擴展速度最快,培養10 d的菌落直徑80.60 mm;在光暗交替條件下,菌絲擴展速度最慢,培養10 d的菌落直徑77.30 mm(見圖6)。
圖6柑桔砂皮病葉分離所得S2菌株在PDA培養基上不同光照條件培養10 d的菌落形態
2.2.5溫度和pH值的影響S2菌株在15～30℃范圍內均能生長,35℃時不能生長,最適合生長的溫度為20～30℃(見圖7)。S2菌株在pH值5～9范圍內均能生長,最適合生長的pH值范圍為5～7。
2.2殺菌劑和納米試劑的室內毒力
3種殺菌劑對S2菌株的抑制作用強,EC50值為40%吡唑醚菌酯·喹啉銅SC<32%噻呋·氟環唑SC<430 g/L戊唑醇SC,抑制效果為40%吡唑醚菌酯·喹啉銅SC>32%噻呋·氟環唑SC>430 g/L戊唑醇SC。3種納米試劑對S2菌株的抑制作用較強,且同種試劑濃度越高,菌落直徑越小,抑制率越高。在納米試劑中,SiO2納米試劑的毒力最強,EC50為1.024μg/mL;星狀陽離子聚合物(SPc)納米載體的毒力最弱,EC50為6.928μg/mL。
3討論與結論
前人研究表明,不同地域條件對病原菌的生物學特性基本無顯著影響,而相同菌株在不同培養條件下的生物學特性存在差異。本研究分離鑒定獲得的柑桔砂皮病菌S2菌株,在不同培養條件下的生物學特性與前人研究結果基本一致。該菌株對甘油、麥芽糖和可溶性淀粉等碳源的利用效果較佳,菌絲擴展速度最快;對蛋白胨氮源的利用效果最好;在15～30℃均能生長,最適生長溫度為20～30℃,致死溫度為35℃;pH值5～9均能生長,最適pH值為5～7;光暗交替培養時,菌落才出現花瓣狀輪紋。
室內毒力測定結果表明,3種殺菌劑對柑桔砂皮病菌S2菌株的抑制作用強,與前人研究結果一致,其中,40%吡唑醚菌酯·喹啉銅SC抑制作用最強,EC50值為1.024μg/mL。供試納米試劑對柑桔砂皮病菌S2菌株均具有較強抑制作用,抑制效果為SiO2納米試劑>土霉素碳量子點納米試劑>星狀陽離子聚合物(SPc)納米載體。SPc納米載體具有高效、簡便及安全的納米傳遞系統,可有效提升藥劑活性,在本試驗中SPc納米載體單獨使用即可達到較好的抑制效果,EC50為6.928μg/mL,后期結合篩選出的化學藥劑,提升效果的潛力巨大,但有待于進一步驗證。國內目前針對柑桔砂皮病菌,室內篩選出的殺菌劑以苯醚甲環唑、吡唑醚菌酯、咪鮮胺、代森錳鋅等殺菌劑為主,EC50范圍為0.099～0.950μg/mL,殺菌效果顯著。測定了33種殺菌劑對柑桔砂皮病菌的毒力,表明雙胍三辛烷基苯磺酸鹽毒力最強(EC50為0.011 2μg/mL),氟硅唑、多菌靈、咪鮮胺錳鹽、吡唑醚菌酯、肟菌·戊唑醇、唑醚·代森聯、苯醚甲環唑、咪鮮胺和戊唑醇的毒力較強(EC50均在1μg/mL以下),并推薦田間以使用氟硅唑和多菌靈為主防控柑桔砂皮病。田間防控砂皮病發現,代森錳鋅等保護性殺菌劑具較好防效,但需連續多次施藥才能達防控效果,人工成本和用藥成本高,且易造成環境污染。將礦物油等增效劑與農藥聯用可以增加農藥黏性,增強藥效,達到減量增效的目的。納米材料具有小尺寸效應、大比表面積、高反應活性、量子效應等理化特性,這些特性使得納米材料應用于農藥時,能提高農藥對生物靶標表面的黏附性和滲透性,減少流失和分解,控制農藥釋放速度,延長農藥持效性,提高農藥利用率。目前在我國還未見關于納米農藥用于柑桔砂皮病防控的報道。本試驗篩選的3種納米試劑對柑桔砂皮病菌都表現出較強的抑制作用,為納米農藥用于柑桔砂皮病的防控提供了依據。
在本研究中,未能測定柑桔砂皮病菌S2菌株的產孢時間及產孢量,也未涉及納米試劑與農藥混合使用的效果及納米試劑對農藥藥效的影響等內容。這有待于進一步研究。
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