平湖紅曲黃酒釀造過程中真菌菌群動態、紅曲霉生長抑制因素（一）
紅曲黃酒是中國黃酒的典型代表，因添加了紅曲釀造，增加了酒體中的活性組分而備受推崇。紅曲霉是紅曲的優勢菌，在紅曲黃酒的釀造過程中發揮著重要作用。其一，紅曲霉作為紅曲黃酒釀造體系中的主要產色菌，其發酵產生的紅曲色素（包括黃色素、橙色素、紅色素3大類）可以賦予紅曲黃酒特征的外觀顏色；其二，紅曲霉的次級代謝產物（紅曲色素、莫納克林K、γ-氨基丁酸、麥角固醇等）豐富了酒體的活性成分，增加了紅曲黃酒的保健功能；其三，紅曲霉強大的酶系能夠催化底物生成醇類、酯類、有機酸等風味物質，豐富了酒體的口感和芳香。
由于紅曲霉對紅曲黃酒的色、香、味及保健功能等品質做出了較為突出的貢獻，因此探明傳統釀造過程中紅曲霉的動態變化和生長機制尤為重要。研究發現紅曲霉在紅曲黃酒傳統釀造過程中的菌量呈不斷下降的趨勢，對其原因并未深入探究。針對紅曲霉生長的抑制因素，除了營養物質的消耗之外，其它微生物的生長代謝也可能會對紅曲霉的生長產生影響。通過變性凝膠電泳技術揭示了紅曲黃酒釀造過程中的優勢細菌為乳桿菌，發酵液酸度的增加可能會抑制紅曲霉的生長；通過宏基因組學技術對海派黃酒釀造過程中真菌菌群動態進行跟蹤測定，試驗結果表明曲霉屬的相對豐度隨釀造時間的延長有所下降，并指出影響其變化的原因可能與酸度、酒精度的增加有關。有學者表明，紅曲黃酒釀造過程中pH值的變化在3.5～5.5范圍內，此酸度適宜紅曲霉的生長繁殖，且適宜濃度的酸、醇能夠促進高溫型紅曲霉的生長。此外，釀造過程中的其它因素亦可能對紅曲霉產生影響，這使得紅曲霉與其生長抑制因素之間的關系變得復雜。
為探明紅曲黃酒釀造過程中紅曲霉的主要抑制因素，本研究將采用分子生態學PCR-DGGE技術及實時熒光定量PCR技術相結合的方法，對平湖紅曲黃酒釀造過程中的真菌菌群動態進行定性、定量分析，并根據紅曲霉菌量不斷減少的趨勢推測其中可能的原因，同時構造相應的體系進行驗證，尋找影響紅曲霉生長的關鍵因子，為探究紅曲霉在發酵過程中的作用機制以及改善紅曲黃酒的品質提供依據。
1材料與方法
1.1材料與試劑
平湖紅曲（Q01），福建省古田縣平湖紅酒曲有限公司；紅曲霉C1，由平湖紅曲中分離純化而得，編號C1，由福州大學食品科學技術研究所保藏。圓糯米，福州市閩侯縣上街鎮糧油站；真菌基因組提取所需試劑、引物、PCR試劑盒、DNA Maker，上海生物工程有限公司；其它試劑均為分析純級。
糯米培養基：用于液化液的制備；糯米和水按質量比1∶1.5的比例混合，在室溫下浸泡8 h，121℃蒸煮20 min。
1.2儀器與設備
SW-CJ-IFD型超凈工作臺，上海博訊實業；GNP-9080型恒溫培養箱，上海精宏；BIO-RAD DcodeTM型梯度變性凝膠電泳，美國伯樂公司；瓊脂糖水平板電泳儀，北京六一公司；JS-380C型凝膠成像分析儀，上海培清；7890A氣相色譜儀，安捷倫。
1.3試驗方法
1.3.1平湖紅曲黃酒釀造及取樣過程將糯米浸泡蒸熟攤涼后，與研磨浸泡后的平湖紅曲（Q01）攪拌均勻，放入滅菌后的酒壇中，25℃糖化5 d，再調整溫度為18℃，密封發酵25 d。紅曲與糯米按質量比1∶10添加，糯米與水添加比例為質量比1∶1.5。取樣時間點設置為發酵前期（第1～7天）、中期（第10天）、后期（第20、30天）。
1.3.2發酵樣品預處理發酵樣品攪拌均勻后，取2.00 g，稱于20 mL無菌生理鹽水中，振蕩均勻后分裝于2 mL離心管中，12 000 r/min離心10 min，棄上清后，沉淀放置-20℃冰箱中凍存備用。
1.3.3孢子懸浮液的制備紅曲霉C1活化結束后，用孢子洗脫液洗下孢子，轉入帶有玻璃珠的三角瓶中，振蕩，充分打散孢子，用4層無菌擦鏡紙過濾去除菌絲，利用血球計數板在光學顯微鏡下計數，制成終濃度為106個/mL的均一孢子懸液，備用。
1.3.4各體系紅曲霉菌量變化的跟蹤方法樣品真菌基因組DNA的提取及實時熒光定量PCR分析。
1.3.5發酵體系的構建模擬傳統：30 g蒸熟糯米、3 g紅曲和45 mL無菌水，三者的質量比與酒壇釀造一致。
純菌發酵：30 g蒸熟糯米、3 mL純菌紅曲霉（C1）菌液，補水至與模擬傳統體系同體積。
體系1（除去曲米）：30 g蒸熟糯米、紅曲處理上清液（3 g紅曲研磨后加生理鹽水充分振蕩，靜置分層，取上清液加入），補水至與模擬傳統體系同體積。
體系2（抑制因子）：30 g蒸熟糯米、無菌的紅曲處理上清液（3 g紅曲研磨后加生理鹽水充分振蕩，靜置分層，取上清液用0.22μm的無菌濾膜過濾）、3 mL純菌紅曲霉（C1）菌液，補水至與模擬傳統體系同體積。
體系3（不同酒精度）：30 g蒸熟糯米、3 mL純菌紅曲霉（C1）菌液、不同體積的乙醇，補水至與模擬傳統體系同體積，最終乙醇的體積分數分別為0，4%，13%，16%，25%，50%。
以上均在100 mL的錐形瓶中30℃下培養。
1.3.6酒精度的測定采用填充柱氣相色譜法。
（1）色譜條件
色譜柱：10%PEG填充柱；載氣：N2；進樣量：1μL；空氣流速：0.2 MPa；H2流速：0.05 MPa；載氣流速：0.3 MPa；氣化室溫度：230℃；柱溫：80℃；檢測器溫度：250℃。
（2）標曲的繪制
吸取無水乙醇配制成質量濃度分別為0，1.0000，1.5000，2.0000，2.5000，3.0000，4.0000 g/L的乙醇工作液，同時配制2.0000 g/L的正丙醇標準液，分別將各質量濃度的乙醇工作液與正丙醇標準液等體積混合后進樣，每個樣品重復2次，得到各質量濃度的乙醇工作液與正丙醇標準液的峰面積比Ai/As，以標樣的峰面積比值的平均值為橫坐標，乙醇的質量濃度為縱坐標，繪制標準曲線。