快速藥敏檢測方法、發展現狀|拉曼光譜在RAST領域中的應用（一）
細菌感染每年導致全球800多萬人死亡,占所有報告的與感染有關的死亡人數的50%以上。在得到準確的藥敏結果前,30%～50%的細菌感染患者接受的一線抗菌藥物治療無效,而且每延遲1 h給予正確的抗菌藥物治療,患者的存活率就會下降10%。為了縮短藥敏檢測時間,各種快速藥敏檢測(RAST)方法被開發出來,如基于光學、電阻抗、微流控、質譜及拉曼光譜等原理的技術,這些技術主要是基于細菌生長或代謝表型的藥敏檢測。但由于不同細菌繁殖速度存在差異,基于細菌生長的技術可能受限,在抗菌藥物作用下,細菌代謝表型的變化會更快。以細菌代謝表型檢測為目的的基于拉曼光譜的藥敏檢測技術已被證明是有前途的RAST替代方案。本文分析細菌耐藥性的流行病學現狀和RAST發展現狀,進一步討論基于細菌代謝表型檢測的拉曼光譜在RAST方面的研究進展,為RAST的研究提供新思路。
1 快速藥敏檢測方法原理
1.1基于光學原理的RAST方法
ZHANG等通過大體積溶液散射成像(LVSI)系統直接對臨床尿液標本成像,并使用單細胞分裂跟蹤方法分析尿液病原菌圖像,在60 min內就得到了藥敏結果,與金標準藥敏結果完全一致。CANSIZOGLU等開發了一種快速超靈敏探測器(RUSD)藥敏檢測平臺,可以檢測到極低細胞密度的細菌,在2～4 h內可測得常用抗菌藥物對金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和大腸埃希菌的最低抑制濃度(MIC)。
1.2基于電阻抗原理的RAST方法
HANNAH等用瓊脂糖基水凝膠沉積物修飾絲網印刷電極,將敏感和耐藥的金黃色葡萄球菌菌株置于含有抗菌藥物的電極上,利用電化學阻抗譜(EIS)和差分脈沖伏安法(DPV)監測細菌生長并建立生長曲線,在45 min內即可區分敏感菌和耐藥菌。PITRUZZELLO等基于電阻抗可直接檢測活細菌代謝的原理,研究抗菌藥物處理下單個細菌的電反應,可在30～60 min內測得藥敏結果。
1.3基于微流控技術的RAST方法
LI等開發了一種在單細胞水平進行快速病原體分類和藥敏試驗的適應性微流控系統,通過結合可調微流體閥和實時光學檢測,細菌被捕獲并根據其物理特征進行分類,在單細胞水平監測它們在抗菌藥物作用下的生長,最短30 min就可以確定細菌的耐藥性。KANDAVALLI等也提出了一種在微流控芯片中基于單細胞水平的藥敏檢測方法,該研究使用4種抗菌藥物和7種細菌的混合標本進行檢測,可在2 h內確定混合標本中各種細菌的藥敏譜。
1.4其他RAST方法
ZHANG等通過核苷酸膠體染料(SYBR GreenⅠ)和碘化丙啶(PI)染色,在30～60 min內檢測到100株肺炎克雷伯菌臨床分離菌株對4種不同抗菌藥物的耐藥性。KLLAI等提出了一種基于流式細胞術的RAST方法,在培養4 h后就能觀察到細菌的生長,藥敏結果的準確率在87%以上。LI等采用基質輔助激光解吸/電離時間飛行質譜法(MALDI-TOF MS)檢測了大腸埃希菌在有無黏菌素條件下的生長狀況,大腸埃希菌與抗菌藥物孵育2 h后,根據敏感株和耐藥株之間的相對生長值測定了黏菌素的MIC。YANG等以肺炎克雷伯菌和環丙沙星為細菌-抗生素模型,采用RNA測序技術確定了細菌暴露于抗菌藥物后的RNA標志物用于藥敏檢測,肺炎克雷伯菌暴露于環丙沙星10 min就可檢測到RNA標志物的變化,然后通過實時定量PCR在11株肺炎克雷伯菌分離株中進行驗證,準確度良好。
2拉曼光譜的基本原理及優勢
拉曼光譜基于非彈性散射原理,是一種非侵入性光譜技術,可用于分子表征和成像,具有高空間分辨率。在生物學中,它特別適用于生物分子的鑒定和細胞的光譜特征分析。傳統的拉曼光譜信號強度低、抗干擾能力弱,檢測時需要較長的積分時間,限制了其在RAST中的應用。
表面增強拉曼光譜(SERS)相比于自發拉曼光譜,有高靈敏度的優點,其基于離域電子集體相干振蕩導致的激光與電磁場耦合,在金屬納米結構之間的間隙連接處或納米間隙處通過局部表面等離子體共振產生“熱點”,從而產生強大的局部電磁場聚焦增強,可以將吸附在金或銀納米粒子上分子的拉曼信號增強1010～1014倍。
共聚焦拉曼光譜(CRS)能有效消除焦平面外的信號干擾,其空間分辨率、信噪比、精度等性能均高于普通拉曼光譜,它與顯微技術聯用,結合可移動的掃描平臺,可在三維空間中精確定位樣品和成像。受激拉曼光譜(SRS)是一種無損的、無標記的振動光譜學方法,通過相干激發分子鍵振動并保留光譜指紋,克服了傳統的自發拉曼散射固有缺點,可實現高速、高化學特異檢測。此外,SRS成像比傳統自發拉曼成像速度快1 000倍以上,且不受樣品自發熒光干擾。
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