不同濃度的檸檬酸鈉對脫氮假單胞桿菌發酵過程的影響——摘要、結論與討論
摘要：維生素B12(Vitamin B12)又稱鈷胺素，通常用來表示含鈷離子的類咕啉(corrinoid)化合物，最早作為“抗惡性貧血因子”在1926年發現。作為一種重要的生理活性物質，維生素B12是許多重要生物化學反應所必需的輔酶，如分子內重排作用、由三磷酸核糖核苷酸生成2′-三磷酸脫氧核糖核苷酸的還原反應、分子間甲基轉移反應等。
由于維生素B12的分子結構極為復雜，其全化學合成需要多達70余個的反應步驟，且成本昂貴，故目前幾乎都是通過微生物發酵的方式來生產維生素B12。而具備維生素B12合成能力的微生物有很多種，但目前成功應用于工業化發酵生產維生素B12的菌株主要有費氏丙酸桿菌(Propionibacteriumfreudenreichii)、謝氏丙酸桿菌(Propionibacteriumshermanii)和脫氮假單胞桿菌(Pseudomonasdenitrificans)等。其中，脫氮假單胞桿菌更是因為其維生素B12產率高，而成為當前應用最廣的維生素B12生產菌株。尤其是通過一系列發酵工藝的優化，脫氮假單胞桿菌的維生素B12工業化發酵水平近年來得到了大幅度的提高，穩定在200 mg/L以上。
并且經過幾十年研究，脫氮假單胞桿菌中維生素B12生物合成途徑已經得到闡明。Wang等利用13C同位素標記代謝流分析的方法考察了維生素B12產生菌脫氮假單胞桿菌的中心代謝網絡，發現糖酵解途徑(EMP途徑)的代謝活性很低，主要利用ED途徑分解代謝葡萄糖，并且存在較大通量的磷酸戊糖途徑(HMP途徑)。有文獻報道檸檬酸鈉結合葡萄糖代謝能阻止微生物發酵過程中副產物的合成，檸檬酸鈉作用于微生物發酵的探究也逐漸深入。劉新星等和陳雙喜等發現檸檬酸鈉能減弱丙酮酸激酶和磷酸果糖激酶的活性，并能抑制EMP途徑和TCA循環之間的“碳源溢流”，增加HMP途徑的通量，大幅度提高肌苷產量。隨后，大量的文獻報道，添加檸檬酸鈉能在不影響菌體正常生長的情況下，減少發酵副產物的生成，改變目標產物合成途徑關鍵點的代謝流分布，提高目標產物合成途徑的代謝流量，提高胞內NADPH、NADH和ATP的水平，促進目標產物的合成和積累。
因此，本文通過搖瓶培養的方式，結合酶學方法，從發酵液pH、菌體生長量、維生素B12產量、有機酸含量和糖代謝途徑的關鍵酶活力等角度出發，考察了不同濃度的檸檬酸鈉對脫氮假單胞桿菌發酵過程的影響，并總結出添加濃度為0.3%的檸檬酸鈉最有利于脫氮假單胞桿菌發酵產維生素B12。
結論與討論
由于維生素B12的化學結構非常復雜，合成過程高度繁瑣。使得應用化學方法來工業化生產維生素B12在技術上存在很大的難度，成本十分昂貴。而在脫氮假單胞桿菌發酵產維生素B12過程中，添加一些維生素B12合成所必需的化合物是非常必要的。例如鈷離子和5，6-二甲基苯并咪唑。另外，在發酵培養基中添加甘氨酸、蘇氨酸、5-氨基乙酰丙酸、甜菜堿和膽堿等甲基供體，也能促進維生素B12的合成，特別是膽堿能增加膜透性。除此之外，不同的無機氮源對P.denitrificans代謝產維生素B12的影響也是不一樣的，彭衛福等通過研究發現，硫酸銨是維生素B12發酵較為適宜的無機氮源，高濃度的NH4+能明顯促進菌體的生長，但是會對維生素B12的合成產生一定的負作用。
為了進一步闡明檸檬酸鈉添加對P.denitrificans代謝途徑所產生的影響，研究發酵過程有機酸和糖代謝途徑關鍵酶酶活力的時序性動態變化發現：在TCA循環中，琥珀酸是由琥珀酰CoA水解生成，而琥珀酰CoA是脫氮假單胞桿菌合成維生素B12的重要前體物質。由此可見，檸檬酸鈉抑制琥珀酸的生成，可能會使得大量的琥珀酰CoA得以流向維生素B12合成途徑。另外，檸檬酸鈉促進蘋果酸的快速利用，產生大量的還原力NADH，更好地滿足了維生素B12合成所需。本文所測定的5個酶均為代謝網絡中的關鍵酶，根據Wang等的研究結果，并結合前文中維生素B12合成量分析推測，在脫氮假單胞桿菌中心代謝途徑中存在較大通量的HMP途徑，這可能是HMP途徑為菌體生長提供大量的前體代謝物，而較高濃度的檸檬酸鈉提高了葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的活力，從而提高了HMP途徑的通量，為維生素B12的合成提供了大量的NADPH，故維生素B12產量大幅度增加。此外，由于檸檬酸鈉與葡萄糖的聯合作用增加了細胞內磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的濃度，而PEP是磷酸果糖激酶的強烈抑制劑，而磷酸果糖激酶的活力受高濃度ATP的抑制，檸檬酸鈉增強了ATP對磷酸果糖激酶的抑制作用，因此減緩了糖酵解途徑的速率。TCA循環中，檸檬酸合成酶的活力也受到了一定的限制作用。由此可見，檸檬酸鈉的添加可增加P.denitrificans中HMP途徑的代謝通量，而這可為維生素B12的合成提供充足的還原力NADPH，從而有利于維生素B12發酵產量的提高。
綜上所述，檸檬酸鈉的添加提高了胞內ATP的含量，增加了HMP途徑的代謝通量，降低了EMP和TCA循環的代謝流量，為維生素B12的合成提供充足的還原力NADPH，有利于維生素B12產量的提高。
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不同濃度的檸檬酸鈉對脫氮假單胞桿菌發酵過程的影響——結果與分析