PlcR在炭疽芽胞桿菌A16R中對其生長狀態、溶血酶活性及神經磷脂酶活性影響（二）
2結果與分析
2.1 PlcR在炭疽芽胞桿菌的表達
2.1.1重組表達菌株構建
表達質粒pBE2A和測序正確的重組質粒pBE2A-電擊轉化DH5a，用引物pBE2_F/R進行菌落PCR鑒定，鑒定正確的克隆提取質粒后電轉入SCS110去甲基化，用相同引物進行菌落PCR鑒定，鑒定正確的克隆提取質粒，電轉A16R，用相同引物進行菌落PCR鑒定。結果顯示重組質粒pBE2A-導入DH5a、SCS110和炭疽芽胞桿菌中A16R中都擴增出特異的條帶，證明重組表達載體pBE2A-已成功轉入炭疽芽胞桿菌中A16R中。
2.1.2 PlcR蛋白的表達、純化及抗PlcR多克隆抗體制備
將基因插入到表達載體pET32a中，構建成重組載體pET32a-，轉化大腸桿菌DH5a和BL21后，用引物pET_F/R進行菌落PCR鑒定，都擴增出特異明亮的條帶，表明表達質粒成功轉入到宿主菌DH5a和BL21中。
PlcR在pET32a中表達，融合蛋白大小為51.5 kDa，pET32a-/BL21誘導表達，用His標簽抗體進行蛋白印跡，結果顯示蛋白條帶大小相符，說明PlcR在BL21成功表達(圖1)。
圖1重組表達載體pET32a-plcR的構建及PlcR蛋白在大腸桿菌中的表達
2.1.3 Western blot確認PlcR在炭疽芽胞桿菌中表達
挑取pBE2A/A16R和pBE2A-/A16R單菌落，LB培養基中培養13 h后，取菌體1 mL進行SDS-PAGE分析(圖2A)，并使用抗PlcR多克隆抗體檢測PlcR是否在炭疽芽胞桿菌中A16R中表達。結果顯示，pBE2A-/A16R所在的泳道有一條明顯的雜交條帶，與PlcR大小相符(33.5 kDa)，因而確定PlcR在炭疽芽胞桿菌中A16R中得到表達(圖2B)。
圖2 PlcR在炭疽芽胞桿菌中A16R中表達
2.2表型分析
2.2.1生長曲線
從0時開始每隔1 h測600值最后繪制生長曲線圖(圖3)。在13 h時炭疽芽胞桿菌中A16R進入對數末期，并且A16R、pBE2A/A16R和pBE2A-/A16R 3株菌的生長曲線趨勢基本相同，差異不太明顯。
圖3生長曲線
2.2.2溶血驗證
用蠟樣芽胞桿菌CMCC63301做陽性對照，同時選A16R做陰性對照，檢測PlcR蛋白表達對炭疽芽胞桿菌中A16R溶血能力的影響。結果顯示：37℃培養過夜后，蠟樣芽胞桿菌CMCC63301菌苔周圍形成明顯的溶血環，A16R、pBE2A/A16R和pBE2A-/A16R均沒有明顯溶血環形成。這表明導入外源基因后A16R的溶血活性沒有恢復(圖4A)。
圖4重組炭疽芽胞桿菌中溶血酶活性和神經鞘磷脂酶活性檢測
2.2.3神經鞘磷脂酶活性驗證
用蠟樣芽胞桿菌CMCC63301做陽性對照，同時選A16R做陰性對照，檢測PlcR蛋白表達對炭疽芽胞桿菌中A16R神經鞘磷脂酶活性的影響，結果顯示：37℃培養過夜后，蠟樣芽胞桿菌CMCC63301菌苔周圍形成很大的神經鞘磷脂酶消化環，A16R、pBE2A/A16R沒有明顯的神經鞘磷脂酶消化環形成，pBE2A-/A16R菌落周圍有明顯的神經鞘磷脂酶消化環形成，但沒有CMCC63301強。這表明導入外源基因后A16R的神經鞘磷脂酶活性得到恢復(圖4B)。
3討論
在近期對炭疽芽胞桿菌PlcR研究報道中，實驗證明導入外源基因能夠使炭疽芽胞桿菌中的溶血酶及神經鞘磷脂酶的活性得到恢復。而在本研究中，在導入外源基因后重組菌株pBE2A/A16R恢復了神經鞘磷脂酶活性，而溶血活性沒有恢復，這與文獻報道的結果并不完全一致。我們猜測基因在炭疽芽胞桿菌中可能具有多種功能，PlcR蛋白單獨就能夠激活神經鞘磷脂酶活性，而受基因調控的溶血素基因的激活可能需要與其他基因的共同作用。有研究稱受基因調控的毒素基因的表達還需要一個小肽PapR的作用，即PlcR的活性依賴于PapR。位于基因下游70 bp，編碼一條48個氨基酸的多肽，其功能是細胞與細胞間的信號傳遞，基因的突變會影響基因的表達，導致溶血素的表達量大量減少，因此，我們推測溶血酶的活性的激活可能需要PlcR與PapR共同作用，但PapR對神經鞘磷脂酶會起到什么樣的作用，仍是未知，這需要我們做更進一步的研究。
PlcR不僅能調控其他蛋白其自身的表達也受自身所調控，且N端較為保守，屬于DNA結合區域，受PlcR調控基因的啟動子區域存在高度保守的回文序列TATGNAN4TNCATA，有報道推測它可能構成了PlcR的識別位點即PlcRbox。眾所周知，炭疽芽胞桿菌與蠟樣芽胞桿菌在遺傳學上有很高的相似性，而且對基因的進化分析表明，蠟樣芽胞桿菌、蘇云金芽胞桿菌和炭疽芽胞桿菌中的基因起源于共同的祖先，那么在炭疽芽胞桿菌中發生的無義突變是在進化過程中自身選擇的原因造成的還是另有他因，尚不明確。本實驗探究了外源基因對炭疽芽胞桿菌的功能影響，另一方面，將炭疽芽胞桿菌中突變的基因重新突變回正常基因，進而研究其對炭疽芽胞桿菌中功能的影響同樣是我們值得考慮的。
因此，我們將構建PlcRpapR融合蛋白及恢復炭疽芽胞桿菌中突變的基因的功能，來進一步研究PlcR在A16R中的功能。
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