大黃魚病原性哈維氏弧菌在試驗菌發酵上清液拮抗下的生長曲線
本文用點種法定性初篩、酶標法及牛津杯法定量復篩，從實驗室保存的在海洋生物體中分離得到的未知海洋微生物中篩選對大黃魚病原性哈維氏弧菌（Vibrio harveyi）具有較強拮抗作用的拮抗菌，并從抗菌譜、生長優勢、藥敏檢測、碳源利用等方面進一步分析目的拮抗菌作為益生菌的特征，以期為大黃魚弧菌病防治及益生菌的開發提供可參考的菌種。
生長曲線繪制
根據酶標儀所測OD630值繪制生長曲線，選取生長曲線上最陡的7個點做生長曲線擬合度直線，直線斜率即為最大生長率(μ)，直線在X軸上的截距為延滯生長期(λ)，生長曲線穩定期切線在Y軸上的截距為最大生物量(A)。根據公式Td=ln2/μ求得倍增時間(Td)，根據公式RI/100=I/(λ×Td)，求得各菌株生長參數(RI)。
拮抗菌的篩選
用點種法在實驗室保存的65株未知的海洋微生物菌株中，獲得18株出現抑菌圈的初篩拮抗菌。酶標法復篩，從生長曲線對比圖1(a,b,c,d)可看出各試驗菌的拮抗效果。在試驗菌發酵上清液拮抗下的指示菌生長曲線居于空白指示菌生長曲線之下的均可能存在拮抗效果。因此，初步確定X15、Y13、Y26、Y36、Z10、X14、Z5、Z9、Y9、Z11、Y27、Z4、Y25、Y24、Z6、Z1具有對指示菌哈維氏弧菌的拮抗作用。
圖1指示菌在試驗菌發酵上清液拮抗下的生長曲線對比圖(a,b,c,d)
通過用牛津杯法直接測量抑菌圈直徑大小，并經過計算機數據分析，計算均值及標準誤差如表1所示，可間接得出酶標法測得的16株試驗拮抗菌對指示菌哈維氏弧菌的拮抗效果，從而確定最佳目的拮抗菌為X14菌株和X15菌株。
表1牛津杯法測得抑菌圈直徑（cm）
益生菌生長曲線
如表2所示，列出了從兩株拮抗菌和兩株病原弧菌生長曲線中推導得到的生長參數，從中可看出兩拮抗菌最大生長率較兩株病原菌大，但最大生物量較兩株病原菌小，延滯期也都較病原菌小，倍增時間都小于兩株病原菌。RI值較大的菌株具有短的延滯期和短的倍增時間，具有生長優勢。兩株拮抗菌在相同的條件下可能較兩株病原菌更具生長優勢，且X14生長優勢強于X15。
表2兩株拮抗菌和兩株病原弧菌生長曲線參數
結論
用點種法定性初篩、酶標法和牛津杯法定量復篩，從海洋生物體上獲得的65株菌中篩選出2株具有較高抗病原哈維氏弧菌的菌株X14、X15為目的拮抗菌。在對兩株益生菌特征分析的研究中，抗菌譜及生長曲線結果顯示菌株X14、X15具有較廣的抗菌性，且兩株拮抗菌在相同的條件下可能較兩株病原菌更具生長優勢。藥物敏感性試驗結果表明，分離菌株對四環素、環丙沙星、慶大霉素、氨芐西林、頭孢噻肟、復方新諾明、頭孢噻吩、利福平、萘啶酸、阿莫西林等10種藥物敏感。16S rDNA基因同源性分析的結果顯示與X14、X15同源性達99%以上的菌株均來自鏈霉菌屬（Streptomyces），進一步建立系統發育樹，結果顯示菌株X15與灰平鏈霉菌（Streptomyces griseoplanus）相似性最高，但結合形態特征及理化性質不能將兩菌株確定到種。篩選得到的菌株X14、X15在拮抗病原哈維氏弧菌、抗菌譜、生長優勢及藥敏性等方面均初步滿足益生菌的篩選條件。
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