基于刃天青微量板法檢測(cè)沙門氏菌抗生素的耐藥性（二）
1.5刃天青工作條件的優(yōu)化
用NB肉湯將沙門氏菌進(jìn)行連續(xù)梯度稀釋，分裝96孔培養(yǎng)板中，每孔加入100μL，終濃度分別為7.5×106、7.5×105、7.5×104、7.5×103、7.5×102、7.5×10 CFU/mL，菌液濃度列間遞減;同時(shí)每孔加入用NB肉湯稀釋的不同濃度刃天青溶液100μL，終濃度為1.600、0.800、0.400、0.200、0.100、0.050、0.025 mmol/L，刃天青濃度行間遞減。設(shè)無刃天青含菌的NB肉湯為陽性對(duì)照，無菌含刃天青的NB肉湯為陰性對(duì)照，37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，每隔1 h觀察顏色變化，檢測(cè)熒光值，熒光激發(fā)波長(zhǎng)為530 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為590 nm，并記錄熒光數(shù)據(jù)。該試驗(yàn)測(cè)量熒光值和觀察顏色變化來評(píng)價(jià)藥物的抑菌效果，選用變?yōu)榉奂t色的時(shí)間為試驗(yàn)所需測(cè)試時(shí)間，并且將能明顯顯示細(xì)菌生長(zhǎng)的刃天青濃度選為工作濃度。
1.6沙門氏菌生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)觀察
取培養(yǎng)的沙門氏菌，用NB肉湯稀釋成不同濃度7.5×106、7.5×105、7.5×104、7.5×103、7.5×102、7.5×10 CFU/mL，分裝于96孔板中，100μL/孔，再每孔加入100μL的工作濃度刃天青溶液，37℃恒溫培養(yǎng)10 h，每隔1 h觀察結(jié)果并同時(shí)檢測(cè)熒光值。
1.7刃天青微量板藥敏試驗(yàn)
將NB肉湯稀釋的刃天青溶液100μL加到無菌的96孔培養(yǎng)板中，將抗生素加入第1孔，1～11孔進(jìn)行梯度稀釋，第12孔不加抗生素作為陽性生長(zhǎng)對(duì)照。向每孔中加100μL培養(yǎng)的沙門氏菌菌懸液，在37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育。選擇對(duì)5種抗生素耐藥或敏感的6株沙門氏菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，根據(jù)顏色變化及熒光值來判斷沙門氏菌是否生長(zhǎng)及其對(duì)所試抗生素的敏感性。
1.8刃天青微量板的應(yīng)用
將蛋洗凈并浸泡在75%乙醇溶液中后，將蛋清和蛋黃在無菌條件下移入無菌均質(zhì)袋中，并用均質(zhì)器打漿2 min以制備懸浮液。通過將25 mL雞蛋混合物添加到175 mL營(yíng)養(yǎng)肉湯中來制備1∶10樣品稀釋液。用該稀釋液將鼠傷寒沙門氏菌稀釋成7.5×106 CFU/mL，然后按照“1.7”方法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。另取樣品100μL，涂布NA瓊脂平板，37℃培養(yǎng)24 h觀察是否雜菌污染。
2結(jié)果與分析
2.1細(xì)菌濃度的確定
為了便于細(xì)菌定量檢測(cè)，用細(xì)菌濁度儀測(cè)定沙門氏菌濁度，取定量稀釋液涂布NA瓊脂平板，培養(yǎng)24 h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。經(jīng)菌落計(jì)數(shù)，計(jì)算出0.5 MCF菌液對(duì)應(yīng)的細(xì)菌培養(yǎng)物的菌落數(shù)為4.15×108 CFU/mL。
2.2刃天青工作條件優(yōu)化
該試驗(yàn)測(cè)試沙門氏菌濃度與刃天青濃度的熒光值和顏色變化，根據(jù)其變化來優(yōu)化測(cè)試條件。其中挑選3個(gè)時(shí)間點(diǎn)來進(jìn)行結(jié)果說明。當(dāng)培養(yǎng)3 h時(shí)，7.5×106 CFU/mL濃度細(xì)菌可使0.025～0.200 mmol/L刃天青變粉紅色。當(dāng)培養(yǎng)6 h時(shí)，細(xì)菌濃度≤103 CFU/mL，均不能使所用7種刃天青濃度變色，這顯示沙門氏菌沒有生長(zhǎng);當(dāng)細(xì)菌濃度≥104 CFU/mL，0.025～0.400 mmol/L刃天青可以顯示沙門氏菌生長(zhǎng)，≥0.800 mmol/L刃天青的顯色時(shí)間相對(duì)滯后，其中高濃度細(xì)菌（7.5×106 CFU/mL）在全濃度刃天青溶液中都變粉紅色。培養(yǎng)12 h后，只有7.5×10 CFU/mL濃度的細(xì)菌在1.600 mmol/L刃天青濃度下不變色，其余濃度的細(xì)菌均可使刃天青變?yōu)榉凵晒鈾z測(cè)結(jié)果所得趨勢(shì)同上。從7.5×105 CFU/mL細(xì)菌在不同刃天青濃度下隨孵育時(shí)間的熒光檢測(cè)結(jié)果（圖1）可以看出，細(xì)菌與刃天青反應(yīng)2 h后熒光差異明顯，0.025～0.100 mmol/L刃天青在5 h內(nèi)還原趨于飽和，0.200～0.800 mmol/L刃天青在5～6 h還原飽和;0.050～0.800 mmol/L刃天青的飽和熒光值接近，說明特定濃度細(xì)菌已被刃天青飽和或過飽和。試驗(yàn)結(jié)果表明，低濃度刃天青產(chǎn)生的熒光信號(hào)低，反應(yīng)不靈敏，而過高濃度的刃天青會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)時(shí)間過長(zhǎng)且熒光檢測(cè)滯后。綜合顏色變化和熒光值，在5個(gè)變色較快的濃度中，0.100 mmol/L刃天青的顯色清晰，熒光值明顯，因此選為刃天青微量板的工作濃度。
2.3沙門氏菌的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)
將不同濃度的沙門氏菌在刃天青微量板上培養(yǎng)12 h，每隔1 h觀察結(jié)果。結(jié)果顯示（表1），當(dāng)細(xì)菌濃度為7.5×102、7.5×104和7.5×105 CFU/mL時(shí)，分別培養(yǎng)8、6和4 h即可見沙門氏菌生長(zhǎng);其中細(xì)菌濃度為7.5×10、7.5×103和7.5×106 CFU/mL時(shí)，分別在10、7和2 h顯示為部分沙門氏菌生長(zhǎng)。由此可見，刃天青微量板進(jìn)行沙門氏菌藥敏試驗(yàn)的判斷時(shí)間可以控制在5 h。
2.4刃天青微量板藥敏試驗(yàn)
用配制好的標(biāo)準(zhǔn)濃度抗生素進(jìn)行沙門氏菌藥敏試驗(yàn)，結(jié)果顯示（表2），不同沙門氏菌分離株對(duì)抗生素氧氟沙星、氨芐西林、環(huán)丙沙星、美羅培南、四環(huán)素或敏感或耐藥。依據(jù)CLSI的最新判斷標(biāo)準(zhǔn)，刃天青微量板與微量肉湯稀釋法藥敏試驗(yàn)得到的耐藥結(jié)果一致。這表明用刃天青微量板法可以在短時(shí)間內(nèi)更為直觀地觀察到耐藥結(jié)果。但在檢測(cè)沙門氏菌對(duì)美羅培南耐藥性時(shí)發(fā)現(xiàn)，因?yàn)樗蒙抽T氏菌對(duì)美羅培南均為完全敏感，可以觀察到在耐藥折點(diǎn)有些菌株會(huì)有極輕微的變色。
在測(cè)量菌株耐藥情況的同時(shí)，選擇性地?cái)U(kuò)大抗生素的濃度范圍，發(fā)現(xiàn)用刃天青微量板法得到的MIC值和微量肉湯稀釋法的MIC值會(huì)有些許差異，沙門氏菌對(duì)環(huán)丙沙星和美羅培南的耐藥性如表3所示。擴(kuò)大濃度范圍后，用2種方法測(cè)得的4株菌的MIC有差異。其中3株菌在測(cè)量對(duì)美羅培南耐藥性時(shí)發(fā)現(xiàn)，用刃天青微量板法檢測(cè)可以得到相對(duì)應(yīng)的MIC值，但用微量肉湯稀釋法檢測(cè)得到的卻為敏感，沒有確切的MIC值。這可能是因?yàn)槿刑烨嘧兩舾校妆蝗巳庋酆蜔晒鈾z測(cè)到，而微量肉湯稀釋法只關(guān)注培養(yǎng)基的渾濁程度，無法精確得到耐藥值。這間接表明刃天青微量板法比肉湯稀釋法更靈敏，對(duì)研究菌株在低濃度抗生素中的生長(zhǎng)情況有幫助，有益于在公共衛(wèi)生方面的用藥安全。
2.5刃天青微量板的應(yīng)用
用氧氟沙星、氨芐西林、環(huán)丙沙星、美羅培南、四環(huán)素5種抗生素對(duì)實(shí)際樣品進(jìn)行刃天青微
量板快速藥敏試驗(yàn)，并同時(shí)進(jìn)行微量肉湯稀釋法藥敏試驗(yàn)對(duì)照，結(jié)果顯示（表4），2種藥敏試驗(yàn)方法的結(jié)果具有良好的一致性。
3結(jié)論
該研究以刃天青為檢測(cè)物質(zhì)，對(duì)食源性致病菌沙門氏菌的耐藥性進(jìn)行檢測(cè)。所用刃天青微量板法得到的MIC與微量肉湯稀釋法進(jìn)行判斷的結(jié)果具有良好的一致性，且更為靈敏、直觀，在5 h內(nèi)就可以得出藥敏結(jié)果。其中肉眼觀察在實(shí)際應(yīng)用中較為方便，不受試驗(yàn)設(shè)備、場(chǎng)地的制約;熒光檢測(cè)可以更清晰地明確耐藥情況，獲得整個(gè)耐藥進(jìn)程，且更為準(zhǔn)確、客觀和結(jié)果可量化。刃天青微量板法彌補(bǔ)了瓊脂法等常規(guī)藥敏試驗(yàn)方法無法動(dòng)態(tài)檢測(cè)細(xì)菌生長(zhǎng)情況的缺陷，其優(yōu)勢(shì)在于其可清晰辨別耐藥折點(diǎn)，動(dòng)態(tài)地檢測(cè)細(xì)菌的生長(zhǎng)狀況，在低濃度抗生素下可以得到更為精確的耐藥值。刃天青微量板法具有簡(jiǎn)便、快速、靈敏、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)，在檢測(cè)各種細(xì)菌對(duì)抗生素的敏感性中有顯而易見的優(yōu)勢(shì)。同時(shí)刃天青法為非特異性檢測(cè)，在實(shí)際檢測(cè)中有更好的應(yīng)用價(jià)值。
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