基于體外重組雞傳染性貧血病毒生長曲線研究復制效率（一）
摘要：為研制新型雞傳染性貧血（CIA）高效疫苗以解決國內商品雞群中普遍存在的雞傳染性貧血病毒（CIAV）感染問題，試驗利用CRISPR-Cas9技術和Cre-LoxP系統，以血清4型禽腺病毒（FAdV-4）為載體，構建表達CIAV VP1蛋白的重組FAdV-4。通過間接免疫熒光試驗和蛋白免疫印跡試驗對重組病毒進行驗證，通過體外病毒生長曲線來研究其復制效率。結果顯示：該重組病毒構建成功，能有效表達CIAV VP1蛋白，命名為rFAdV-4-CIAV-VP1，且發現rFAdV-4-CIAV-VP1在LMH細胞中的復制效率遠低于野生型FAdV-4。研究表明構建的重組病毒rFAdV-4-CIAV-VP1為CIAV和FAdV-4的聯防聯控提供了二聯候選疫苗株。
雞傳染性貧血病毒（Chicken infectious anemia virus，CIAV）感染主要引起以雛雞再生障礙性貧血與全身性淋巴組織萎縮為特征的免疫抑制性疾病，同時導致機體對其他病原易感性增加以及對疫苗免疫應答降低。盡管CIA商品化弱毒活疫苗在種雞中使用廣泛，國內商品雞群中CIAV與其他病毒的混合感染較為普遍，嚴重制約了國內養雞業的健康發展。CIA商品化弱毒活疫苗不適用于免疫雛雞，對雛雞存在潛在的感染致病風險。由于在細胞和雞胚上均很難獲得高滴度的CIAV，迄今為止，國內外市場上尚無商品化的CIAV滅活疫苗的報道。有研究報道，將重組桿狀病毒在昆蟲細胞中共同表達VP1和VP2蛋白的細胞裂解物去免疫雞群，可以有效刺激雞群產生中和抗體，且該抗體可以保護子代雞免受CIAV感染。然而，目前同樣缺少基于重組桿狀病毒的CIA亞單位商品化疫苗。因此，研發新型CIA疫苗對高效免疫防控CIA及其他病毒病至關重要。
血清4型禽腺病毒（Fowl adenovirus serotype 4，FAdV-4）感染主要導致肝炎-心包積液綜合征。自從1987年在巴基斯坦報道以來，FAdV-4逐漸向周邊國家擴散。2015年以來，國內雞群大面積暴發高致病性FAdV-4，雞群感染死亡率高達30%~80%，對國內養雞業造成了巨大的經濟損失。值得注意的是，本課題組前期研究發現CIAV感染可大大降低雞群對FAdV-4疫苗的免疫應答。最近，本課題組利用CRISPR-Cas9技術編輯FAdV-4的fiber-2基因，分別創制了EGFP與Fiber-2融合，EGFP代替Fiber-2以及Fiber-2部分缺失的重組FAdV-4基因工程弱毒候選疫苗，證明了fiber-2基因的可編輯性以及FAdV-4作為載體開發表達外源基因的重組基因工程疫苗的可行性。為研制新型CIA高效疫苗以解決國內商品雞群中普遍存在的CIAV感染問題，本試驗利用CRISPR-Cas9技術和Cre-LoxP系統，將FAdV-4中的fiber-2基因替換為CIAV的保護性抗原基因VP1，成功獲得了表達CIAV的VP1蛋白的新型重組病毒rFAdV-4-CIAV-VP1，從而為探索有效防控CIAV和FAdV-4感染的新技術奠定基礎。
1材料與方法
1.1試驗材料
1.1.1細胞、病毒、抗體和質粒
雞肝癌細胞系（LMH）來源于美國菌種保藏中心（ATCC），在含有10%胎牛血清（購自Lonsera公司）的Dulbecco's Modified Eagle Medium/F12（購自Gibco公司）培養基中培養，37℃、5%CO2。所用的CIAV毒株T1P6和FAdV-4毒株SD2015均由本實驗室分離、保存。表達綠熒光蛋白（EGFP）的重組FA4-EGFP由本實驗室構建和保存?？笴IAV VP1蛋白的單克隆抗體2E3，抗FAdV-4 Hexon蛋白的單克隆抗體1B5，抗FAdV-4 Fiber-2的單克隆抗體1C9，抗FAdV-4的Fiber-1蛋白的單克隆抗體3B5和抗FAdV-4的多克隆抗體雞血清均由本實驗室制備、保存。攜帶紅色熒光蛋白（RFP）表達盒的質粒pMD19-HAL-LoxP-RFP-LoxP-HAR和表達Cre重組酶的質粒pcDNA3.1-Cre均由本實驗室構建和保存。
1.1.2主要試劑及儀器
主要試劑：2×Taq Master Mix、Phanta Super-Fidelity DNA聚合酶、DL5000 DNA Marker、核酸膠回收試劑盒、質粒小提試劑盒和一步克隆法試劑盒（CloneExpressTM II One Step Cloning Kit）均購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；DNA Super Marker、RIPA裂解液（強）和ECL超敏發光液均購自康為世紀生物科技有限公司；轉染試劑Mirus購自MIRUS公司；Opti-MEM培養基和蛋白Marker均購自賽默飛世爾科技有限公司；蛋白酶和磷酸酶抑制劑購自蘇州新賽美公司；GAPDH單抗購自武漢艾博抗有限公司；羊抗鼠IgG-HRP購自Jackson Immuno Research公司；羊抗鼠IgG-FITC和羊抗雞IgG-FITC均購自KPL公司。
構建重組病毒策略見圖1：
主要儀器：ETC811型PCR擴增儀購自蘇州東勝興業科學儀器有限公司；DK-8D型37℃恒溫水浴鍋購自上海精宏實驗設備有限公司；BB15型隔水式電熱恒溫培養箱購自賽默飛世爾科技有限公司；MQL-61R型恒溫搖床培養箱購自上海旻泉儀器有限公司；5804R型低溫超速離心機購自德國Eppendorf公司；Tanon 2500型凝膠成像系統與Tanon 5200全自動化學發光圖像分析系統均購自TANON公司；SW-CJ-2F型醫用凈化工作臺購自蘇州安泰空氣技術公司；Ti2-U型倒置熒光顯微鏡購自日本尼康公司。