老年萎縮性胃炎患者幽門螺桿菌根治方法及藥物敏感性研究（二）
2.2根治方案的選擇
對于Hp培養結果呈陽性者，采用鉍鉍劑四聯[枸櫞櫞酸鉍鉍鉀+質子泵抑制劑(PPI)+2種抗生素]或者無鉍鉍劑三聯治療，均治療14d。抗生素包括阿莫西林、克拉霉素、左氧氟沙星、四環素、甲硝唑(北京索萊寶科技有限公司生產)。遵循安全、有效的治療標準。治療期間禁止吸煙、飲酒、食用辛辣刺激食物，禁止服用胃腸道損傷藥物，若出現嚴重不良反應則應返院評估。治療完成后患者停藥4~8周返院復查13C-UBT,若檢測結果呈陰性則判定為根治,否則為根治失敗。
2.3克拉霉素耐藥性分析
采用瓊脂稀釋法測定藥物最低抑菌濃度。將1~2μl的Hp菌液(0.5麥氏比濁管濃度)分別接種于含有不同濃度的克拉霉素、阿莫西林、甲硝唑、左氧氟沙星、四環素的哥倫比亞血平板上，以無抗生素藥物的血瓊脂平板、質控菌株NCTC11637(上海北諾生物科技有限公司提供)為陰性對照。將平板置于厭氧罐中，控制氧濃度，加入適量無菌雙蒸水，37℃條件下培養5d。最終以無細菌生長的最低抗生素濃度為最小抑菌濃度，根據美國臨床試驗標準委員會制定的耐藥臨界值范圍進行判定，克拉霉素、阿莫西林、甲硝唑、左氧氟沙星、四環素的臨界值分別為的1μg/ml、8μg/ml、8μg/ml、2μg/ml、2μg/ml，超過以上臨界值則表示存在耐藥性。
2.4克拉霉素耐藥菌株突變位點分析
用細菌基因組DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司產品)提取Hp基因組DNA,并以此為模板設計23S rRNA引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。正向引物:5’-GGACGCATAGGGTTAAGC-3’;反向引物:5’-CTCCATAAGAGCCAAAGCCC-3’。擴增片段為715 bp。PCR反應體系:Es Taq Master Mix 25μl,DNA模板2μl,正、反向引物各1μl(10μmol/L),ddH2O 1μl。反應條件:94℃預變性5 min;94℃變性1 min,52℃退火1 min,72℃延伸1 min,共30個循環;72℃延伸10 min。采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產物并測序(由北京六合華大
基因科技股份有限公司完成),采用ClustalW軟件與國際標準菌株U27270的23S rRNA基因(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)比對分析測序結果,尋找突變位點。
2.5統計學處理
采用SPSS19.0軟件進行統計學分析。計數資料以例數(百分數)的表示,進行X2檢驗。采用Logistic回歸法分析老年萎縮性胃炎患者發生Hp感染的影響因素。P<0.05為差異有統計學意義。
3、結果
1 Hp感染情況及危險因素分析
148例老年萎縮性胃炎患者中檢出Hp感染108例，感染率為72.93%。經多因素Logistic回歸分析顯示，吸煙、暴飲暴食、進食辣食、有家族性胃腸道疾病史是老年萎縮性胃炎患者發生Hp感染的危險因素(均P<0.05),進食酸奶是Hp感染保護因素(P<0.05)(表1)。
表1 Hp感染危險因素分析
2 Hp根治方案效果比較
108例患者經治療后88例(81.48%)Hp根治，其中PPI+阿莫西林+克拉霉素、PPI+枸櫞櫞酸鉍鉍鉀+替硝唑+克拉霉素治療方案的根治率超過80%。其他方案的根治率為66.67%~83.33%，差異無統計學意義(x2=2.180,P=0.848)(表2)。
表2 Hp不同治療方案根治情況
3 Hp藥物敏感性
藥敏檢測顯示，Hp對克拉霉素、阿莫西林、甲硝唑、左氧氟沙星、四環素的耐藥率分別為35.19%、13.89%、41.67%、53.70%和18.52%(表3)。
表3 Hp藥物敏感性
44克拉霉素耐藥基因突變位點分析
108株Hp中共成功分離出克拉霉素耐藥菌株38株，提取基因組以及PCR擴增后獲得715 bp大小的基因片段。ClustalW比對分析顯示，成功測序22株克拉霉素耐藥菌株23SrRNA基因，共有6個突變位點，A1821G、G1826A、T1830C、A2143G、T2182C、A2223G，其中A1821G、G1826A、T1830C存在于所有(耐藥、敏感)菌株中。12株耐藥菌株存在A2143G突變，突變率為54.55%;20株耐藥菌株存在T2182C突變，突變率為90.91%;8株耐藥菌株存在A2223G突變,突變率為36.36%(表4)。
表4 Hp克拉霉素耐藥基因突變位點分析
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