不同溫度、包裝方式的草莓中蠟樣芽孢桿菌生長曲線（一）
摘要：在對草莓的病源微生物污染調查中發現蠟樣芽孢桿菌具有高的檢出率。為比較不同溫度和不同包裝方式的草莓表面蠟樣芽孢桿菌數量的變化情況，測定了7℃、15℃、25℃、30℃的溫度條件下，采用保鮮盒包裝和保鮮膜包裝方式的草莓表面蠟樣芽孢桿菌生長數據；選用Baranyi Roberts模型為初級模型，擬合不同溫度和不同包裝方式的草莓中蠟樣芽孢桿菌生長曲線，并對模型進行驗證。
結果顯示，7℃冷藏的蠟樣芽孢桿菌均增長緩慢而與包裝方式無關；15℃低溫貯藏過程中，膜裝與盒裝延滯期基本相同，但膜裝比盒裝降低了0.7 lg cfu/g的生長勢，說明保鮮膜在此溫度下有一定的抑菌作用；在25℃、30℃儲藏下兩種包裝方式的比生長速率和延滯期基本相同，蠟樣芽孢桿菌在42 h后分別增長了2.9 lg cfu/g、3.2 lg cfu/g，表明貯藏溫度是影響蠟樣芽孢桿菌的主要因素。因此在高溫條件下蠟樣芽孢桿菌會帶來潛在的食用安全風險。本研究結果為微生物定量風險評估提供重要信息。
草莓因其風味獨特、質地柔軟受到廣大消費者的喜愛，但其柔軟質地和高含糖量也成為微生物繁殖生長的溫床。對草莓等即食果蔬安全評價和管控措施多集中在農藥殘留等方面，但有研究表明，草莓表面的微生物也可成為其食用安全的隱患。蠟狀芽胞桿菌是典型的菌體細胞，分布廣，對熱等致死因子有較強的抵抗力，在農業上部分菌株被作為生態調節劑進行開發和利用。但某些蠟樣芽孢桿菌會產生嘔吐毒素和多種腸毒素而會引起食物中毒，公認食物中毒類型為嘔吐型和腹瀉型，典型腸毒素為溶血致死腸毒素BL(Hbl)、非溶血性腸毒素（Nhe）和細胞毒性腸毒素（CytK）等，由于此菌不分解蛋白質，因此食品在感官上無明顯變化，易誤食發生食物中毒，我國1973-2013年的食物中毒事件中，由蠟樣芽孢桿菌引起的中毒事件占所有食物中毒的構成比12.95%（位居第二）。蠟樣芽孢桿菌在我國的產品標準中少有限量，但在多數境外標準中有限量要求，見表1所示。
預測微生物學(predictive microbiology)是一門建立在微生物學、數學、統計學基礎上的新興學科，微生物預測模型的建立為微生物定量風險評估(QMRA)和危害分析關鍵控制點(HACCP)提供了科學依據，是管理食品安全的重要工具。
表1國內外即食食品中蠟樣芽孢桿菌限量要求
本研究結合多年草莓中蠟樣芽孢桿菌的檢出數據及宏基因組方法對草莓表面微生物群落的調查，通過擬合草莓上市時溫度和常見不同包裝方式下蠟樣芽孢桿菌在草莓中的生長情況，建立各溫度下細菌預測模型，并進行模型可靠性驗證，旨在推薦合理的草莓貯藏方式，為開展定量風險評估和保障草莓質量安全提供理論基礎。
1材料與方法
1.1材料、試劑
1.1.1材料
草莓，120份樣品購于成都大型超市及成都某生產基地，每年度40份樣品。蠟樣芽孢桿菌（ATCC 11778）。
1.1.2試劑
甘露醇卵黃多黏菌素瓊脂(MYP)、緩沖蛋白胨水（BPW）、營養瓊脂，購于廣東環凱生物科技有限公司；0.75%NaCl，法國梅里埃公司；乙腈（色譜純）、乙醇（色譜），Fisher Scientific公司；甲酸（色譜純），TEDIA公司；α-氰基-4-羥基肉桂酸（CHCA）(suitable for MALDI-TOF-MS)，SIGMA公司。實驗用水均為ddH2O。
1.2方法
1.2.1草莓中蠟樣芽孢桿菌的計數
草莓蠟樣芽孢桿菌污染調查草莓的計數方法參照4789.14食品安全國家標準食品微生物學檢驗蠟樣芽胞桿菌檢驗法一。確定性驗證采用基質輔助解析電離飛行時間質譜法（MALDI-TOF MS）方法。
質譜前處理：取菌適量加入70%乙醇水溶液0.75 mL，震蕩30 s，常溫40 kHz超聲10 min，離心1 min棄上清，加入75%乙酸水溶液0.75 mL震蕩20 s，加入0.75 mL乙腈震蕩均勻，常溫40 kHz超聲10 min，離心1 min取上清1μL點至靶板，加入1μL CHCA，晾干。
質譜條件：模式Mode liner SARAMIS，能量角75～85，收集范圍2000～20000（m/z），每樣品100次收集峰疊加，校準品ATCC 8739大腸桿菌。收集質譜圖譜導入SARAMIS數據庫與數據庫中與標準菌株的譜圖進行多重比較，獲得鑒定相關結果。
1.2.2生長模型的建立
實驗設置在7℃、15℃、25℃、30℃條件下設置溫度點，在0 h、3h、6h、9 h、18 h、21 h、23.5 h、26.5 h、29 h、31 h、41 h、45 h、52 h、72 h、75 h選擇溫度點進行蠟樣芽孢桿菌計數，將數據導入ComBase數據庫的在線軟件，選取Baranyi模型作為一級模型進行曲線擬合，方程式：
式中：t為時間，h；Y(t)為t時的菌數，cfu/g；Y0為初始菌數，cfu/g；Y max為最大菌數，cfu/g；μmax為最大比生長速率；λ表示遲滯時間，h；h0表示初始時細胞的生理狀態。
1.2.3模型的驗證
為了評價建立的動力學模型預測值的可靠性，實驗采用準確因子（Accuracy factor，Af）、偏差因子（Bias factor，Bf）和均方根誤差（Root Mean Square Error，RMSE）對預測值和實測值進行分析檢驗。RMSE、Af和Bf表達式見公式（4～6）
式中：Nobs表示實測值，Npre表示應用模型得到的預測值，n是觀測值個數。
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