烏梅等20種中藥的體外抗胸膜肺炎放線桿菌活性研究【?藥敏試驗】（一）
【目的】觀察烏梅Fructus mume等20種中藥的體外抗胸膜肺炎放線桿菌Actinobacillus pleuropneumoniae活性.【方法】通過乙醇回流、水煎煮和超聲波等方法對20種中藥進行提取，采用二倍稀釋法測定其對胸膜肺炎放線桿菌的體外抗菌活性;并研究抗菌活性較強的幾味中藥的體外聯合抑菌活性.【結果和結論】烏梅、黃連Rhizoma coptidis、訶子Terminalia chebula、秦皮Cortex fraxini、地榆Sanguisorbae officinalis、虎杖Polygonum cuspidatum 6種中藥提取物對胸膜肺炎放線桿菌的最小抑菌濃度(Minimal inhibitory concentration，MIC)范圍是6.25～50.00 mg/mL;大青葉Isatis indigotica、茵陳Artemisia capillaris、甘草Glycyrrhiza uralensis和白鮮皮Dictamnus dasycarpus 4種中藥提取物的MIC范圍是50.00～100.00 mg/mL;黃柏Phellodendron amurense、杜仲Eucommia ulmoides、金銀花Lonicera japonica、柴胡Bupleurum chinense、蒲公英Taraxacum mongolicum、板藍根Baphicacanthus cusia、梔子Gardenia jasminoides和黃芪Astragalus membranaceus等10種中藥提取物的MIC＞100.00 mg/mL.聯合抑菌試驗結果表明，烏梅、黃連、訶子和虎杖兩兩聯合抑菌指數(FICI)≤1，烏梅、虎杖分別與秦皮的FICI＞2.烏梅、黃連、訶子、虎杖、秦皮、地榆對胸膜肺炎放線桿菌均具有較好的體外抗菌活性;烏梅、黃連、訶子和虎杖兩兩聯合為相加、協同作用;秦皮分別與烏梅、虎杖為拮抗作用.
胸膜肺炎放線桿菌Actinobacillus pleuropneumoniae屬巴氏桿菌科嗜血桿菌屬，后根據其表型和DNA雜交水平均與放線桿菌屬模式種密切相關，歸屬為巴氏桿菌科放線桿菌屬.常與巴氏桿菌等混合感染，是引起豬上呼吸道感染的主要病原菌之一.主要引起豬傳染性胸膜肺炎，表現為急慢性炎癥，急性死亡率較高，常伴隨豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染，是一種高度傳染性疾病.目前豬傳染性胸膜肺炎的治療主要采用抗菌藥物，如氟苯尼考、鹽酸環丙沙星等，大量抗菌藥物的使用，增加了胸膜肺炎放線桿菌的耐藥性，同時由于抗菌藥物的濫用，造成藥物殘留和環境污染等諸多社會問題.針對抗菌藥物所帶來的諸多問題，獸醫臨床急需尋找低毒有效的抗菌藥物替代品，以控制疾病的發生.據研究報道，中藥或天然植物提取物，可發揮對病原菌的直接殺滅作用不產生耐藥性.因此如何從中藥中尋找抗胸膜肺炎放線桿菌新藥已經成為藥物開發的熱點.本研究選擇烏梅、黃連等20種具有抗菌活性的中藥，提取其不同部位，研究其對胸膜肺炎放線桿菌的體外抗菌活性，以期為篩選得到對胸膜肺炎放線桿菌具有抗菌作用的中藥及其復方奠定基礎.
1材料與方法
1.1材料
烏梅Fructus mume(產地四川，批次：120315)、黃連Rhizoma coptidis(產地四川，批次：080406)、訶子Terminalia chebula(產地云南，批次：081121)、虎杖Polygonum cuspidatum(產地四川，批次：081102)、柴胡Bupleurum chinense(產地甘肅，批次：080301)、板藍根Baphicacanthus cusia(產地甘肅，批次：080921)、黃柏Phellodendron amurense(產地四川，批次：080923)、大青葉Isatis indigotica(產地四川，批次：100310)、杜仲Eucommia ulmoides(產地云南，批次：080916)、蒲公英Taraxacum mongolicum(產地貴州，批次：100217)、白鮮皮Dictamnus dasycarpus(產地遼寧，批次：080914)、茵陳Artemisia capillaris(產地河北，批次：080923)、秦皮Cortex fraxini(產地山西，批次：100330)、梔子Gardenia jasminoides(產地廣西，批次：080622)、黃芪Astragalus membranaceus(產地陜西，批次：040824)、魚腥草Houttuynia cordata(產地四川，批次：100310)、甘草Glycyrrhiza uralensis(產地甘肅，批次：081102)、夏枯草Prunella vulgaris(產地河南，批次：101114)、地榆Sanguisorbae officinalis(產地陜西，批次：040827)、金銀花Lonicera japonica(產地四川，批次：080919)20種中藥均購于四川雅安惠民堂藥業連鎖有限責任公司，由四川農業大學藥學系副教授范巧佳鑒定為正品.
胸膜肺炎放線桿菌(ATCC265)，購買于中國獸藥監察所.含質量分數為0.02%煙酰胺腺嘌呤二核甘酸(NAD)的TSB液體培養基、含質量分數為0.02%NAD的TSA固體培養基.96微孔細胞培養板、SPX型生化培養箱、旋轉蒸發儀、索氏提取器等.
1.2方法
1.2.1 20種中藥有效部位的提取烏梅、黃連、訶子、虎杖等20種中藥按文獻的方法進行有效部位的提取，壓縮烘干成浸膏.
1.2.2藥液制備將20種中藥提取物浸膏溶于二甲基亞砜中，配制成質量濃度為1 g/mL的儲備液，高壓蒸汽滅菌，4℃冰箱保存.
1.2.3有效部位抗菌活性研究參照美國臨床實驗室標準化委員會(Clinical and Laboratory Standard Institute，CLSI)推薦的對細菌敏感性檢測方案，采用試管二倍稀釋法，測定20種中藥有效部位提取物對胸膜肺炎放線桿菌的最小抑菌濃度(Minimal inhibitory concentration，MIC);用TSA瓊脂平板涂板法測定20種中藥有效部位提取物對胸膜肺炎放線桿菌的最小殺菌濃度(Minimal bactericidal concentration，MBC).
菌液制備：采用平板菌落計數法確定菌液濃度.將胸膜肺炎放線桿菌菌液進行10倍系列稀釋，分別取不同稀釋度的菌液0.1 mL滴加于含質量分數為0.02%NDA的TSA平板上，用無菌涂布器涂布均勻，每稀釋度重復2塊平板，37℃溫箱中培養18～24 h.選取菌落數在30～300個的平板進行計數，每組稀釋度相同的平板取平均值作為菌落數.計算出原菌液細菌濃度，作為細菌菌液的標準濃度.