林氏扇頭蜱抗菌肽重組蛋白對大腸埃希菌生長曲線影響及抑菌效果（四）
2.4.3不同濃度重組蛋白對大腸埃希菌生長曲線、時間-殺菌曲線的影響
從生長曲線中可看出，空白對照組在培養2 h后進入快速對數生長期，并于9 h時達到穩定期。相比之下，1/8×MIC處理組雖能抑制大腸埃希菌的生長，但抑制作用較弱；1/4×MIC處理組顯著抑制了大腸埃希菌的生長，菌體數量直至10 h后才開始增加；而1/2×MIC、1×MIC處理組則完全抑制了大腸埃希菌的生長。除6 h時對照組與1/8×MIC處理組的OD600 nm差異無統計學意義，其余時間各處理組的OD 600 nm均低于對照組，差異有統計學意義（P<0.05），重組蛋白能延緩大腸埃希菌的生長速度，且其抑菌活性呈現濃度依賴性。見圖3A。
圖3不同濃度Microplusin-like對大腸埃希菌生長曲線（A）和時間-殺菌曲線（B）的影響
時間-殺菌曲線顯示，與對照組相比，經重組蛋白處理的大腸埃希菌活菌數在5 min內均下降（P<0.05）；1×MIC處理組曲線在15 min內略有下降，隨后趨于平穩并略有上升，說明該濃度蛋白對大腸埃希菌有一定的抑制作用，但未能有效殺滅細菌；4×MIC處理組曲線顯著下降，在60 min左右達到最低點，隨后略有上升，說明該濃度藥物具有較強的殺菌活性，使菌落形成單位數大幅降低，重組蛋白濃度與殺菌效果呈正相關。見圖3B。
2.5重組蛋白抑菌機制探究
2.5.1電子顯微鏡分析
與對照組相比，經重組蛋白處理后的細菌細胞質膜和細胞壁出現破損，內容物外泄，導致細胞內部松散（圖4A~圖4B），菌體明顯皺縮，邊緣模糊，菌體間相互粘連（圖4C~圖4D）。
圖4經Microplusin-like處理后大腸埃希菌透射電鏡（TEM）及掃描電鏡圖（SEM）注：紅色箭頭為菌體受損部位；A、B、D.×20 000；C.×22 000。
2.5.2分子對接
Microplusin-like三維模型由6段α-螺旋結構盤旋而成的相對緊湊的穩定折疊形態，具有3個二硫鍵（圖5A~圖5B）。在Microplusin型蛋白中，二硫鍵有助于整體折疊的穩定性，特別是保持α-螺旋的位置。對結構進行PROCHECK評估，97.6%的殘基落在最理想的區域（圖5C），這些區域代表了穩定的二級結構，高比例的核心區域表明蛋白質結構大致符合理想構象，可用于后續分析。
圖5 Microplusin-like的三維結構模型及PROCHECK評估結果注：A.Microplusin-like三維結構模型；B.Microplusin-like的Carton結合Sticks結構；C.PROCHECK評分圖。
Microplusin-like重組蛋白與脂多糖轉運蛋白（4RHB）分子對接的最佳構象所示，2個蛋白主要通過氫鍵進行接觸，二者之間的多個氨基酸如：4RHB的Arg657、Lys346、His785、Arg623、Glu573、Arg565、Ser318、Arg326與重組蛋白的Glu67、His89、Asp87、Ser66、Thr33、Gln58、Ala62、Ala78、Thr14形成氫鍵；His785和Asp55形成鹽橋。在分子對接結果2D可視化圖中能看到相同的作用。此外，重組蛋白還與Arg542、Thr258、Glu275、Ser446、Asn782、Thr783、Asn328、Tyr613、Leu784、Lys490、Gln781、Arg511、Gln366、Val572、Asn576、Leu533、Gln323、Arg277、Leu279、Asn369產生疏水相互作用。見圖6~圖7。
圖6 Microplusin-like與脂多糖轉運蛋白的分子對接結果注：A.Microplusin-like與4RHB對接構象Surface模型，紫色代表Microplusin-like，藍色代表4RHB；B.Microplusin-like與4RHB對接構象Carton模型；C.Microplusin-like與4RHB對接構象細節圖，蛋白1的碳原子顯示為藍色，其中黃色虛線為形成的氫鍵，綠色虛線為形成的鹽橋。
圖7分子對接結果2D可視化注：綠色虛線為形成的氫鍵，紅色虛線為鹽橋作用；黑色為C原子，紅色為O原子；藍色為N原子；扇形標記氨基酸為涉及疏水接觸的非配體殘基。
3討論
蜱是一類以吸血為生的節肢動物，不僅生活在適合微生物繁殖的潮濕、復雜的環境中，在吸血過程中也隨時面臨病原微生物的入侵。節肢動物缺通常乏獲得性免疫系統，主要依賴先天性免疫系統來抵御病原體入侵，抗菌肽是昆蟲先天免疫系統中的一類重要的免疫效應因子，不僅能直接清除入侵的細菌、真菌等病原微生物，還具有介導免疫細胞趨化、調控細胞凋亡、促進免疫應答和傷口愈合等生物學功能，在蜱生物防治及開發新型抗菌藥物中具有發展潛力。
本試驗通過生物信息學方法分析林氏扇頭蜱抗菌肽Microplusin-like基因，CAMPR3在線網站涵蓋了原核生物和真核生物抗菌肽序列、結構及家族特異性特征，通過該數據庫檢索和對抗菌肽家族特征檢索，能夠預測蛋白序列是否具有抑菌性；CAMPR3利用多種算法，如支持向量機、隨機森林等來預測，給出一個0~1的概率分數，分數>0.5的序列具有潛在抑菌活性，分數越高，表示蛋白為抗菌肽的可能性越大；GRAVY反映的是整體親水性（負值為親水），GRAVY為負值的抗菌肽可能通過破壞細菌膜（疏水區）發揮作用，但其自身需要具備一定親水性以溶于液體，為后續發揮抗菌作用奠定基礎；Wimley-White專注于膜界面局部的疏水性（正值為疏水）；Boman index指數較高（2.50~3.00）意味著抗菌肽于細胞內部具備多樣化的功能特性，這是由于它能夠和多種不同的蛋白質產生相互作用，與之相反，數值越低（≤1），表明抗菌肽副作用越小（比如溶血活性處于較低水平），僅具備單一抗菌功能的概率較大。生物信息學預測顯示該蛋白具有潛在抑菌活性，這與后續試驗中重組蛋白對革蘭陰性菌的抑制作用相呼應，說明預測方法具有一定的參考價值。
抑菌試驗結果顯示，重組蛋白對大腸埃希菌及沙門菌等革蘭陰性菌具有抑制作用，表現出中度或高度敏感。不同菌株的抑菌圈直徑、MIC和MBC數據表明其抑菌活性存在差異，這可能與菌株的細胞壁結構、膜通透性以及耐藥機制不同有關。而對金黃色葡萄球菌等革蘭陽性菌無效，這與已知的微小扇頭蜱種的Microplusin對革蘭陽性菌具有抑制效果的研究結果有所不同，可能是氨基酸序列差異、蛋白表達后修飾不同導致，這一推測有待進一步研究。從抑菌活性的濃度依賴性來看，隨著重組蛋白濃度增加，對大腸埃希菌的抑制和殺菌效果增強，在生長曲線和時間-殺菌曲線試驗中均有明顯體現。但在4×MIC濃度下，細菌數量后期仍會回升，可能是蛋白濃度不夠高，或者細菌產生耐藥性或適應性，這與臨床抗菌藥物使用中面臨的問題相似。透射電鏡及掃描電鏡結果表明，重組蛋白能夠損傷菌體細胞壁及細胞膜的形態及結構，使其內部物質泄漏，還可觀察到重組蛋白使胞內密度明顯降低，有可能是直接干擾了細胞內過程，從而達到殺菌效果。脂多糖轉運蛋白（4RHB）是大腸埃希菌細胞膜的重要結構，它們的抑制劑被認為是治療細菌感染的有效候選化合物。分子對接用于研究多肽與指示菌關鍵結構蛋白之間的相互作用，分子對接結果表明重組蛋白與大腸埃希菌外膜脂多糖轉運蛋白會產生相互作用也驗證了重組蛋白能破壞外膜穩定性，與微小扇頭蜱Microplusin蛋白通過螯合銅離子抑制菌的呼吸的抑菌機制有所不同，但也不排除多種機制共同作用，這有待進一步的研究。
本試驗成功構建pCold-SUMO/Microplusin-like重組表達載體，其表達產物具有抗大腸埃希菌及沙門菌等革蘭陰性菌活性，初步分析抗菌機制為破壞細胞壁及細胞膜結構，為開發新型生物活性抑菌劑的研發提供了新的可能性。