攜帶抗生素耐藥基因沙門菌P1噬菌體-質粒效價、形態、一步生長曲線及最適溫度（二）
1.2.3 P1-CTX噬菌體-質粒最佳感染復數測定
感染復數(multiplicity of infection，MOI)=噬菌體數量(plaque forming unit，PFU)/宿主菌數量(colony forming units，CFU)。不同MOI的效價最高時，即為最佳感染復數。受體菌沙門菌BYC4分別按照MOI值為：10-6、10-5、10-4、10-3、10-2、10-1、1、10混勻，37℃振蕩培養4 h，過濾器除菌后將噬菌體10倍稀釋后，噬菌斑法測定噬菌體效價，每組試驗3個平行。
1.2.4 P1-CTX噬菌體-質粒一步生長曲線測定
噬菌體和受體沙門菌BYC4，按照最佳感染復數混勻。參照屈平平的研究，方法略有改動。每隔15 min取100μL，梯度稀釋后噬菌體斑法測定其效價，每組試驗3個平行。感染時間為X軸，噬菌體效價的log值為Y軸，繪一步生長曲線圖。爆發量為裂解末期噬菌體效價/感染初期宿主菌濃度。
1.2.5 P1-CTX噬菌體-質粒最適生長溫度測定
P1-CTX噬菌體-質粒分別于30℃、40℃、50℃、60℃、70℃和80℃水浴，分別在30、60和90 min各取3管，稀釋后測其效價。
1.2.6 P1-CTX噬菌體-質粒pH穩定性測定
P1-CTX噬菌體-質粒分別加入900μL不同pH(2~13)的SM Buffer，37℃室溫靜置，分別30、60和90 min各取3管樣品，稀釋后測其效價。
1.2.7 P1-CTX噬菌體-質粒轉導及宿主適應性測定
沙門菌或大腸埃希菌受體菌與噬菌體混合，涂布于含CTX 1 mg·L-1的LB固體培養基平板上。PCR的方法驗證頭孢噻肟瓊脂培養基上轉導菌株。
轉導成功的大腸埃希菌和沙門菌及其原菌37℃連續培養12 h。使用酶標儀每隔2 h測定600 nm吸收光下細菌濃度變化。每組實驗設置3個平行計數。
1.2.8 P1-CTX噬菌體-質粒穩定性測定
轉導成功的大腸埃希菌和沙門菌及其原菌37℃連續培養24 h。1∶1 000連續重復傳代30 d。每組試驗設置3個平行計數。
1.2.9數據統計
利用GraphPad prism 5對數據進行處理分析。
2結果
2.1 P1-CTX噬菌體-質粒效價
為評估沙門菌J46中P1噬菌體-質粒能否被誘導并釋放出感染子代顆粒，選用噬菌體誘導劑絲裂霉素C，在時間維度上不同溫度條件下進行研究。選取對數期OD600=0.5沙門菌J46四種不同溫度26℃、32℃、37℃、42℃分別連續誘導20 h。結果顯示，不同溫度均可產生感染噬菌體顆粒(圖1)。其中，溫度為37℃和42℃時，誘導時間1 h即有噬菌體產生，誘導時間在4~6 h，噬菌體效價最高，可達約106 PFU·mL-1，隨著時間的延長，噬菌體效價緩慢下降。溫度為26℃和32℃時，誘導時間6 h時可觀察到噬菌體產生，當誘導時間延長到20 h時，其效價仍低于37℃時誘導的最佳效價。
圖1 P1-CTX噬菌體-質粒效價
2.2 P1-CTX噬菌體-質粒形態
沙門菌J46中可誘導P1-CTX噬菌體-質粒，由噬菌斑照片可知，P1-CTX產生的裂解斑塊直徑為1~2 mm，且清晰(圖2A)。P1-CTX噬菌體-質粒屬于肌病毒科，透射電鏡下可觀察到P1-CTX由頭部和尾部組成，頭部為球狀直徑約60~80 nm。尾部約為120~160 nm，且與頭部相連的尾部有髓鞘包裹，尾部可清晰地觀察到中空的尾管結構，與已公布的標準P1噬菌體一致(圖2B)。
A.P1-CTX噬菌斑；B.透射電子顯微鏡下P1-CTX噬菌體形態
圖2 P1-CTX噬菌體-質粒噬菌斑和電鏡下形態
2.3 P1-CTX噬菌體-質粒最佳感染復數MOI
為檢測噬菌體P1最佳感染復數，噬菌體和受體菌共培養后通過噬菌斑計數試驗檢測。結果如表1所示，當P1-CT噬菌體-質粒和受體菌比例為0.01時，為最佳感染復數，可產生最多的噬菌體子代，噬菌體效價為1.97×108 PFU·mL-1。隨著MOI值的降低，噬菌體效價值呈現明顯下降，而隨著MOI值的增大，噬菌體效價變化幅度較小，均維持在108 PFU·mL-1水平。
表1 P1-CTX噬菌體-質粒最佳感染復數
2.4 P1-CTX噬菌體-質粒一步生長曲線
噬菌體的裂解周期，其增殖過程包括五個階段，分別為吸附、核酸注入、DNA合成、噬菌體粒子組裝和裂解細胞釋放。噬菌體的吸附、增殖和裂解可用一步生長曲線描述。由圖3可以看出，P1-CTX噬菌體-質粒從吸附到裂解釋放出噬菌體顆粒的潛伏期為45 min，從檢測出噬菌體到噬菌體數量達到頂值，裂解期持續約50 min，約100 min后達到平臺期，裂解末期噬菌體數量約為1.0×108 PFU·mL-1，P1噬菌體的裂解量為63 PFU·cell-1。
圖3 P1-CTX噬菌體-質粒一步生長曲線
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