lmo1508/lmo1509基因缺失對單增李斯特菌生長曲線、抗氧化應激能力的影響（四）
2.6 氧化條件下Δlmo1508/lmo1509缺失株中熒光值的檢測
選擇轉錄水平上升幅度最高且具有顯著差異性的Δlmo1508/lmo1509進一步研究，TCS缺失株Δlmo1508/lmo1509的熒光值在BHI、5 mmol/L Cu2+和10 mmol/L Fe3+環境下極顯著高于參考菌株10403S（圖6），說明lmo1508/lmo1509對gsh-px具有負調控作用。
圖6 Δlmo1508/lmo1509中pFL516的表達
2.7 lmo1508/lmo1509缺失對LM生長能力的影響
生長能力測定結果顯示，缺失株Δlmo1508/lmo1509與親本株10403S在BHI培養基中的生長趨勢相似（圖7），表明lmo1508/lmo1509基因不影響菌株10403S的生長能力。
圖7 親本株10403S和缺失株Δlmo1508/lmo1509生長曲線測定
2.8 lmo1508/lmo1509缺失對LM抗氧化應激能力的影響
通過氧化應激試驗結果得知，在5 mmol/L Cu2+應激處理后，lmo1508/lmo1509缺失使得LM的存活能力顯著降低，10 mmol/L Fe3+的應激處理后，lmo1508/lmo1509缺失使得LM的存活能力極顯著降低（圖8），說明lmo1508/lmo1509對LM的抗氧化應激能力存在正調控影響。
A. 5 mmol/L Cu2+；B. 10 mmol/L Fe3+。
圖8 Δlmo1508/lmo1509在金屬離子中的存活率比較
3 討論
LM入侵宿主的過程中會遇到多種應激條件，氧化應激是其中最常見的一種。為了避免氧化損傷，LM產生強大的酶促抗氧化系統使胞內促氧因子和抗氧因子保持平衡。
GSH-Px是一種重要的抗氧化酶，廣泛存在于真核生物和原核生物中。雖已知真核生物中GSH-Px可以利用GSH作為電子供體將過氧化物還原為水和氧，在介導細胞抗氧化應激的過程中作用顯著，但是人們對原核生物中的GSH-Px知之甚少。此前，在原核生物中很少有關于gsh-px基因的報道。大腸桿菌中有編碼gsh-px的同源基因btuE，對其功能研究表明，這種酶可以防止各種氧化劑的有害影響，讓細胞對氧化應激不那么敏感。腦膜炎奈瑟菌中gsh-px的同源基因gpoA的失活增加了該突變體對氧化還原循環劑百草枯誘導的氧化應激的敏感性。這些研究均表明gsh-px參與了氧化應激防御。另有研究發現，在小鼠皮下感染模型中，敲除gpoA的腦膜炎奈瑟菌毒力明顯受損，首次為gsh-px參與細菌致病性提供了證據。GSH-Px或許在原核生物的抗逆性和細菌毒力方面起著重要作用，但其具體的轉錄調控機制目前仍不清楚。目前報告系統是研究轉錄調控的重要方法，其中GFP是一種經典的報告系統。將目的基因的啟動子與GFP相連后，對GFP的熒光強度進行測定即可檢測基因的轉錄表達水平，具有易于檢測、靈敏度高、熒光性質穩定、對細胞無毒害、可直接用于活細胞檢測等優點，具有極廣泛的應用前景。
本研究成功構建gsh-px報告質粒并將其電轉入LM野生株10403S感受態中。通過熒光顯微鏡和酶標儀檢測Pgsh-px的表達情況，攜帶報告質粒的LM菌株10403S-pFL516在顯微鏡下發出明亮的綠色熒光，且通過酶標儀測得的熒光強度顯著高于野生對照株，該質粒在LM中可表達GFP，表明該質粒中攜帶的gsh-px啟動子具有轉錄活性，為下一步試驗奠定了良好基礎和技術平臺。
LM 10403S基因組編碼16組TCS，為了篩選可能參與調控gsh-px的TCS，我們試圖分別敲除每組TCS，但最終只成功敲除了14組。將報告質粒分別電轉入14對TCS缺失株感受態中，通過測定熒光值，證實其中7個TCS的缺失導致gsh-px基因轉錄水平上調，說明它們與gsh-px啟動子之間存在負調控關系；6個TCS的缺失則導致gsh-px基因轉錄水平下調，說明它們與gsh-px啟動子之間存在正調控關系，lmo2500/lmo2501的缺失使得其熒光值相對于親本株而言無顯著差異。前期的研究中發現GSH-Px對H2O2帶來的氧化應激不敏感，對銅和鐵金屬離子帶來的氧化應激敏感。進一步對轉錄水平上升幅度最高且具有顯著差異性的lmo1508/lmo1509這一TCS研究發現，在BHI、5 mmol/L Cu2+和10 mmol/L Fe3+條件下，Δlmo1508/lmo1509的熒光值極顯著高于親本株10403S，說明lmo1508/lmo1509對gsh-px具有負調控作用。生長能力測定結果表明lmo1508/lmo1509基因不影響菌株的生長；氧化應激試驗結果顯示，相對于親本株，Δlmo1508/1509的抗氧化應激能力顯著降低，說明lmo1508/lmo1509對LM的抗氧化應激能力存在正調控影響。
綜上所述，本研究利用gfp成功構建了可以反映gsh-px啟動子轉錄活性的pFL516報告質粒，并成功篩選出調控GSH-Px的雙元調控系統lmo1508/lmo1509，為進一步探究該TCS在LM中如何調控GSH-Px的功能奠定了基礎。
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