內酯型槐糖脂對白色念珠菌生長抑制和生物膜形成的影響（二）
2.3LSL對白色念珠菌細胞微觀結構的影響
使用SEM觀察LSL處理不同時間后白色念珠菌細胞微觀結構的變化。處理組取培養好的對數生長期白色念珠菌菌液(菌濃已調整為1 x106CFU/mL)，以2.0%(v/v)接種量將其接種到LSL濃度為MIC值的50mL液體培養基中,對照組取上述白色念珠菌菌液接種于等體積未添加LSL的液體培養基中。分別在培養2、4、8、12h時各取出3 mL培養物于6000r/min(離心半徑9.25cm)離心10 min收集菌泥，PBS溶液洗滌3次后使用2.5%戊二醛在4℃冰箱中固定12h,PBS溶液洗滌3次后離心并分別以乙醇梯度脫水(50%，70%，80%，90%，100%)，真空條件下干燥，噴金，SEM觀察并拍照。
2.4LSL對白色念珠菌細胞膜通透性和完整性的影響
使用CLSM觀察LSL處理前后白色念珠菌細胞膜通透性和完整性的變化。使用熒光探針羧基熒光素雙乙酸酯(FDA)和碘化丙啶(PI)標記和區分活細胞與死細胞。分別在培養2、4和12h時取按2.3步驟制備的處理組和對照組細菌懸液各500μL,4℃下6000r/min離心10min后收集菌體，等體積PBS溶液重懸后加入cFDA使其終濃度為100μmol/L,避光反應10min后加入PI使其終濃度為30μmol/L,避光反應10min后10000r/min離心2min收集菌體，PBS溶液重復洗滌3次，最終將菌體懸浮于500μL PBS中。吸取3.0μL菌液置于CLSM下觀察并拍照。
2.5LSL對白色念珠菌胞內ATP含量的影響
通過測定胞內ATP濃度的變化，分析LSL對白色念珠菌細胞膜通透性的影響。按2.3步驟制備處理組和對照組細菌懸液,分別在培養不同時間后取樣,將上述樣品在10000r/min下離心1min后分別收集菌體和上清液置于冰上備用。取菌體按照ATP測定試劑盒說明書處理樣品并測定和計算樣品胞內ATP含量。每組測定實驗重復3次，每次測定設置3個平行。
2.6LSL對白色念珠菌胞外紫外吸收物質含量的影響
取2.5中制備所得上清液樣品,使用酶標儀分別測定其在波長為260nm下的吸光度值,評估LSL處理不同時間后白色念珠菌胞外紫外吸收物質(主要為核酸和蛋白質等)濃度的變化。
2.7 LSL對白色念珠菌生物膜形成的影響
采用結晶紫染色法評估LSL對白色念珠菌生物膜形成的抑制作用。取100mu L培養至對數生長期的白色念珠菌菌液(菌濃調整為1x106CFU/mL)與等體積LSL溶液混合,使LSL終濃度為0~20mg/mL。37℃下共孵育24h后將液體輕輕吸出，使用PBS溶液清洗3次以去除浮游細胞,其余貼壁細胞使用99%甲醇固定15 min,之后將甲醇吸出并靜置,待甲醇完全揮發后加人100μL0.1%結晶紫染色5min。染色結束后將染液吸出并使用PBS清洗3次,最后加入100μL 95%乙醇溶解細胞中結合的結晶紫。以未經LSL處理菌液為對照組，以波長600nm處測定的吸光度為生物膜質量的量度,參照生物膜抑制率公式計算LSL對白色念珠菌的生物膜抑制率。每組實驗重復3次。生物膜抑制率(%)=[1-(實驗組A600÷對照組A600)]x 100%。
2.8數據處理與分析
采用GraphPad Prism 8.0軟件對數據進行統計和繪圖。結果以平均值±標準偏差(x±s)表示，多組比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統計學意義。
3、結果
3.1、LSL對白色念珠菌MIC和MFC
實驗結果顯示，當LSL濃度為6.00mg/mL時，最終菌液與初始菌液的A_{600}差值穩定在5%以內;當LSL濃度為18.00 mg/mL時,平板上無菌落生長。因此，LSL對白色念珠菌的MIC為6.00mg/mL，MFC為18.00mg/mL。如無特殊說明,后續實驗中所使用的LSL處理濃度均為LSL對白色念珠菌的MIC值。
3.2、LSL對白色念珠菌生長的影響
圖1為以12h為一生長周期繪制所得的LSL對白色念珠菌浮游細胞的時間-抑菌率變化曲線。可以發現，LSL對白色念珠菌浮游細胞的生長抑制效應快速且顯著，且抑制效果隨LSL濃度的增加而提升。其中,0~2h內的抑菌率增速最快,2h后8.00mg/mL的LSL即可發揮穩定的抑菌效果;當濃度高于8.00 mg/mL時,LSL還表現出明顯的殺菌和溶菌作用,此結果與LSL對白色念珠菌的MIC和MFC測定結果一致。
3.3、LSL對白色念珠菌細胞微觀結構的影響
使用SEM考察LSL對白色念珠菌細胞微觀結構的影響。最小抑菌濃度的LSL與白色念珠菌相互作用2、4、8、12h后的菌體微觀形態如圖2所示。未經LSL處理的空白對照菌體表面光滑，形態完整且飽滿，細胞壁邊緣清晰，界限明顯，菌體呈橢球狀形態(圖2A);LSL處理2h后大部分菌體形態完整，少量細胞形態發生改變，表現在菌體出現凹陷、皺縮和塌陷現象，部分內容物外泄(圖2B);LSL處理4h后菌體皺縮現象更加明顯，少量菌體出現破損現象(圖2C);LSL處理8h后，部分細胞失去完整形態，菌體破損嚴重呈“爆破”狀，且內容物外泄產生的粘性使破損細胞聚集在一起，細胞間界限不再明顯(圖2D);LSL處理12h后，所有細胞均變形且嚴重破損，菌體因被部分溶解而黏連在一起聚集成團(圖2E)。LSL處理不同時間后白色念珠菌細胞的微觀形態變化表明，LSL具有很強的群體生長抑制作用，菌體細胞壁和細胞膜的完整性均遭到了不同程度的破壞。
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