棘孢木霉TCS007菌株的固態(tài)發(fā)酵條件、次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)量影響因素（四）
2.3固態(tài)發(fā)酵優(yōu)化后粗提發(fā)酵產(chǎn)物的抑菌活性
按照上述確定的最佳優(yōu)化固態(tài)發(fā)酵條件，即大米72 g、加水量47 mL、初始pH 7.0、接種量1 mL、光照周期12 h/12 h、培養(yǎng)溫度28℃、培養(yǎng)時(shí)間29 d、黃豆粉添加量(質(zhì)量分?jǐn)?shù))3.5%進(jìn)行發(fā)酵，得到的TCS007菌株粗提發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)10種植物病原真菌的抑菌活性測(cè)定結(jié)果。從中可看出，優(yōu)化發(fā)酵條件后所得粗提發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)供試植物病原真菌具有廣譜的抑菌活性，在50μg/mL質(zhì)量濃度下，其對(duì)油菜菌核病菌、蘋果褐斑病菌、黃瓜灰霉病菌和水稻紋枯病菌的抑制率分別為96.87%、77.42%、71.07%和62.50%，其中對(duì)蘋果褐斑病菌和黃瓜灰霉病菌的抑制率明顯高于陽(yáng)性對(duì)照啶酰菌胺。
以其中抑制效果最好的油菜菌核病菌為靶標(biāo)，開(kāi)展了毒力測(cè)定、菌核形成及萌發(fā)影響試驗(yàn)。結(jié)果表明：優(yōu)化發(fā)酵方法后所得TCS007菌株粗提發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)油菜菌核病菌的EC50值為0.51μg/mL，初始發(fā)酵方法所得粗提發(fā)酵產(chǎn)物的EC50值為17.91μg/mL，優(yōu)化后活性提高了35倍。說(shuō)明采用優(yōu)化后的發(fā)酵方法能夠產(chǎn)生更多具有抑菌活性的次生代謝產(chǎn)物。
優(yōu)化發(fā)酵方法后所得TCS007菌株粗提發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)油菜菌核病菌菌核形成的影響結(jié)果。培養(yǎng)15 d后，在EC50值0.51μg/mL質(zhì)量濃度下，TCS007菌株粗提發(fā)酵產(chǎn)物處理組菌核數(shù)量明顯低于對(duì)照組，抑制率為63.93%，可顯著減少油菜菌核病菌菌核的形成。
采用優(yōu)化后發(fā)酵方法所得TCS007菌株粗提發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)油菜菌核病菌菌核萌發(fā)的影響結(jié)果。培養(yǎng)12 h時(shí)，空白對(duì)照組菌核開(kāi)始萌發(fā)，但0.51μg/mL TCS007菌株粗提發(fā)酵產(chǎn)物處理組對(duì)菌核萌發(fā)的抑制率為100%，說(shuō)明在前12 h該粗提物可完全抑制菌核的萌發(fā)；培養(yǎng)24 h后，所有處理組菌核均開(kāi)始萌發(fā)，且隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)菌核萌發(fā)數(shù)逐漸升高；培養(yǎng)48 h時(shí)，所有處理組中菌核萌發(fā)率均達(dá)到了100%。據(jù)此可知，TCS007菌株粗提發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)油菜菌核病菌菌核萌發(fā)有一定的抑制作用，但這種抑制作用僅在萌發(fā)初期有效，表明TCS007菌株粗提發(fā)酵產(chǎn)物能夠抑制油菜菌核病菌菌核的萌發(fā)，且主要作用為推遲菌核的萌發(fā)時(shí)間。
3結(jié)論與討論
棘孢木霉TCS007菌株能夠產(chǎn)生具有抑菌活性的次生代謝產(chǎn)物，這是其作為有益微生物應(yīng)用于生防領(lǐng)域的重要前提。木霉屬真菌對(duì)數(shù)量龐大的植物病原真菌、細(xì)菌甚至病毒具有廣譜的生物活性，可用于植物病害的生物防治領(lǐng)域，也是目前開(kāi)發(fā)產(chǎn)品最多的植物病害生防菌。木霉可產(chǎn)生多種不同類型的次生代謝產(chǎn)物，而這些物質(zhì)即是木霉抗生素類作用活性的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。木霉活菌制劑由于貨架期短、使用劑量高以及產(chǎn)品穩(wěn)定性差等因素，限制了其廣泛應(yīng)用。然而，木霉的次生代謝產(chǎn)物卻可能與化學(xué)制劑一樣，具備良好的產(chǎn)品穩(wěn)定性和較長(zhǎng)的貨架期。因此，在植物病害生物防治領(lǐng)域，利用木霉的次生代謝產(chǎn)物研究開(kāi)發(fā)新型殺菌劑，無(wú)疑有著巨大的科研與應(yīng)用價(jià)值。
王晗昕通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)曲面法優(yōu)化，顯著提高了藍(lán)木霉(Trichoderma caerulescens)TW21990-1色素粗提發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)量。本研究同樣通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)曲面法，優(yōu)化了棘孢木霉TCS007菌株的固態(tài)發(fā)酵條件，結(jié)果表明：培養(yǎng)時(shí)間、黃豆粉添加量和加水量是影響粗提發(fā)酵產(chǎn)物產(chǎn)量的3個(gè)關(guān)鍵因素。優(yōu)化后的培養(yǎng)基及發(fā)酵條件為：大米72 g，培養(yǎng)時(shí)間29 d、黃豆粉添加量3.5%、加水量47 mL、光照周期12 h/12 h、培養(yǎng)溫度28℃、接種量1 mL(孢子濃度1×107個(gè)孢子/mL)、初始pH 7.0。在此最優(yōu)發(fā)酵條件下，粗提發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)量為1.21 g，采用淺盤發(fā)酵法進(jìn)一步擴(kuò)大發(fā)酵，粗提發(fā)酵產(chǎn)物產(chǎn)量可達(dá)1.45 g，較初始發(fā)酵方法所得粗提發(fā)酵產(chǎn)物產(chǎn)量提高了1.61倍。Kaur等也曾以大米作為培養(yǎng)基底物發(fā)酵木霉菌株，結(jié)合統(tǒng)計(jì)建模，結(jié)果表明：通過(guò)響應(yīng)曲面法優(yōu)化可顯著提高發(fā)酵產(chǎn)物產(chǎn)量和抗真菌活性。陳書峰等通過(guò)淺盤發(fā)酵也顯著提升了綠色木霉(Trichoderma viride)的纖維素酶產(chǎn)量。
以優(yōu)化后的培養(yǎng)基不接種TCS007菌株作為培養(yǎng)基對(duì)照，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基對(duì)照所得粗提發(fā)酵產(chǎn)物在4μg/mL質(zhì)量濃度下對(duì)油菜菌核病菌幾乎不存在抑制活性，而優(yōu)化發(fā)酵方法后所得TCS007菌株粗提發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)油菜菌核病菌的抑制活性顯著增強(qiáng)，EC50值為0.51μg/mL，比初始條件下的粗提發(fā)酵產(chǎn)物(EC50值17.91μg/mL)提高了35倍。許銘玉等發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.5%的黃豆粉時(shí)，所得TCCC 21101菌株發(fā)酵濾液的抑菌活性最高。本研究所得結(jié)論與之類似，表明優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)條件不僅可提高活性代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量，還可能促進(jìn)了新的抑菌活性物質(zhì)的產(chǎn)生，而這些活性代謝產(chǎn)物并不是由培養(yǎng)基本身產(chǎn)生的。
木霉屬真菌產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物抗菌譜廣，例如已明確的6-戊基-2H-吡喃-2-酮、綠膠霉(viridin)及木霉素等均可抑制多種植物真菌病害。本研究中優(yōu)化發(fā)酵方法后的TCS007菌株粗提發(fā)酵產(chǎn)物在50μg/mL質(zhì)量濃度下，對(duì)油菜菌核病菌、水稻紋枯病菌、蘋果褐斑病菌和黃瓜灰霉病菌的抑制率在62.50%~96.87%之間，值得注意的是，其中對(duì)蘋果褐斑病菌和黃瓜灰霉病菌的抑制率甚至高于陽(yáng)性對(duì)照啶酰菌胺。此外，優(yōu)化后所得TCS007菌株粗提發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)油菜菌核病菌菌核形成的抑制率可達(dá)63.93%。王琳的研究表明，由化學(xué)合成所得的斑蝥素衍生物(cantharidin derivatives)對(duì)核盤菌有一定抑制作用，能推遲其菌核萌發(fā)時(shí)間，但不能抑制菌核的最終萌發(fā)。本研究結(jié)果與之類似，棘孢木霉TCS007菌株粗提發(fā)酵產(chǎn)物在EC50濃度下對(duì)油菜菌核病菌的菌核萌發(fā)也有一定抑制作用，但同樣僅在萌發(fā)初期有效。
綜上，本研究表明，棘孢木霉TCS007菌株的代謝產(chǎn)物在生物防治領(lǐng)域具有廣闊的研究及應(yīng)用前景，所得結(jié)果可為海洋木霉資源的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)及綠色可持續(xù)農(nóng)業(yè)的推進(jìn)提供重要參考，關(guān)于TCS007菌株粗提發(fā)酵活性產(chǎn)物的具體化學(xué)成分及結(jié)構(gòu)有待進(jìn)一步研究，未來(lái)可通過(guò)液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(LC-MS)以及基因組學(xué)等手段深入解析其活性成分。此外，TCS007菌株固態(tài)發(fā)酵大規(guī)模生產(chǎn)所得產(chǎn)物的穩(wěn)定性以及田間應(yīng)用效果等均有待進(jìn)一步驗(yàn)證。
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