小龍蝦貯藏過程中優(yōu)勢腐敗菌篩選、及微生物菌群結(jié)構(gòu)分析（三）
2.4 4℃貯藏小龍蝦高通量測序結(jié)果分析
2.4.1小龍蝦4℃貯藏期間微生物群落的α-多樣性
α-多樣性分析可以反映小龍蝦樣品中微生物的多樣性（豐富度及均勻度），由多種指數(shù)進(jìn)行評價(jià)，主要包括反映微生物群落豐富度的Ace指數(shù)、Chao 1指數(shù)和Richness指數(shù)，可以體現(xiàn)微生物群落多樣性的Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)，以及覆蓋率。
表3不同貯藏時(shí)期小龍蝦微生物群落的α-多樣性
由表3可知，Ace指數(shù)、Chao 1指數(shù)及Richness指數(shù)隨著貯藏時(shí)間的延長逐漸減小，這說明小龍蝦樣品在貯藏過程中微生物群落豐富度不斷降低，微生物群落中物種種類逐漸減少，出現(xiàn)了優(yōu)勢菌屬。而代表樣品中微生物群落多樣性的Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)也均降低，表示貯藏過程中小龍蝦樣品的微生物多樣性也在逐步降低，物種均勻度下降。說明在小龍蝦貯藏后期，出現(xiàn)了在數(shù)量上占絕對優(yōu)勢的細(xì)菌，并且這些細(xì)菌可能抑制了其他種類細(xì)菌的生長，從而降低了微生物群落的多樣性。
圖4不同貯藏時(shí)間小龍蝦稀釋曲線（A）和Shannon曲線（B）
稀釋曲線體現(xiàn)對小龍蝦樣本的取樣深度，可以用來評估測序量的合理性。由圖4A可知，隨著測序深度的增加，小龍蝦稀釋曲線逐漸平緩，說明測序量足夠且充分，測序樣本能夠合理反映樣品中物種信息。由圖4B可知，Shannon指數(shù)曲線也逐漸趨向平緩，代表微生物多樣性不會(huì)再增加。同時(shí)表3中覆蓋率均大于99%，因此，上述數(shù)據(jù)可以證明小龍蝦樣本的高通量測序數(shù)量合理，且能夠正確反映出小龍蝦樣品中微生物的多樣性及豐富度。
2.4.2小龍蝦4℃貯藏期間細(xì)菌群落的β-多樣性
圖5小龍蝦細(xì)菌菌群的主成分分析
對4℃貯藏小龍蝦細(xì)菌群落進(jìn)行基于操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）的主成分分析（principal component analysis，PCA），PCA是通過降維處理展現(xiàn)樣本特定距離的分布方法，PCA圖中不同樣品間距離的遠(yuǎn)近可以反映不同樣本相似性的大小。由圖5可知，PC1、PC2的解釋度分別為68.08%和20.03%。從樣品分布可以看出，貯藏0 d樣本與貯藏16 d的樣本距離最遠(yuǎn)，說明其菌群組成差異最大。相對而言，貯藏8、12、16 d的樣本則較為聚集，表示雖然這些樣本之間存在一定的差異，但其菌群結(jié)構(gòu)還是具有較高的相似度，而貯藏12 d與16 d樣本距離最小，說明二者菌群結(jié)構(gòu)相似度最高。小龍蝦細(xì)菌菌群β-多樣性的分析結(jié)果顯示，小龍蝦中微生物結(jié)構(gòu)在貯藏過程中不斷發(fā)生變化，最終造成鮮樣期小龍蝦與腐敗末期小龍蝦微生物結(jié)構(gòu)之間產(chǎn)生較大的差異。
2.5小龍蝦貯藏期間微生物物種組成及聚類分析
圖6不同貯藏時(shí)期小龍蝦OTU韋恩圖
對測序得到的序列進(jìn)行聚類分析，以98%以上的序列聚類成OTU，并根據(jù)不同貯藏時(shí)間小龍蝦樣本所對應(yīng)的OTU繪制維恩圖。由圖6可知，貯藏0、8、12、16 d樣品含有的OTU數(shù)分別為2 830、1 379、1 121和977。貯藏12 d（腐敗中期）與16 d（腐敗末期）樣品中相同的OTU數(shù)為674，高出貯藏0 d（鮮樣期）與16 d（腐敗末期）樣品約500，因此可以說明腐敗中期與腐敗末期的小龍蝦樣品微生物物種相似度更高。
圖7不同貯藏時(shí)間小龍蝦中微生物的屬水平物種組成
由圖7可知，從整體上看，小龍蝦樣品中物種組成差異較大。總共涉及到17個(gè)菌屬，包括氣單胞菌屬（Aeromonas sp.）、希瓦氏菌屬（Shewanella sp.）、黃桿菌屬（Flavobacterium sp.）、變形桿菌屬（Proteus sp.）、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobactor sp.）、叢毛單胞菌屬（Comamonas sp.）、漫游球菌屬（Vagococcus sp.）等，高通量測序法除傳統(tǒng)培養(yǎng)法篩選到的10株細(xì)菌外還鑒定出黃桿菌屬、叢毛單胞菌屬和漫游球菌屬等7個(gè)菌屬，體現(xiàn)了高通量測序法的準(zhǔn)確性及全面性。隨著貯藏時(shí)間的延長，小龍蝦鮮樣期相對豐度較大的細(xì)菌，如叢毛單胞菌屬、漫游球菌屬逐漸減少，而氣單胞菌屬、希瓦氏菌屬相對豐度則逐漸增加并成為優(yōu)勢菌群。在鮮樣期（0 d），氣單胞菌屬、希瓦氏菌屬相對豐度分別為1.40%、0.82%。而隨著貯藏時(shí)間的延長，其相對豐度迅速增大，在貯藏末期（16 d），2種細(xì)菌的相對豐度分別達(dá)到38.7%、18.9%。結(jié)合傳統(tǒng)培養(yǎng)法在小龍蝦中篩菌結(jié)果可知，本實(shí)驗(yàn)中小龍蝦樣品的優(yōu)勢腐敗菌為氣單胞菌及希瓦氏菌。冷藏小黃魚的優(yōu)勢腐敗菌為變形桿菌及希瓦氏菌，而朱素芹等在凡納濱對蝦中篩選得到的優(yōu)勢腐敗菌則為希瓦氏菌及不動(dòng)桿菌，與本研究中產(chǎn)自武漢孝感的4℃貯藏小龍蝦中篩選分離得到的優(yōu)勢腐敗菌為希瓦氏菌及氣單胞菌有所差異，可能是由于不同品種的水產(chǎn)品優(yōu)勢腐敗菌有所差異。而本研究優(yōu)勢腐敗菌種類與先前研究得出的小龍蝦中優(yōu)勢腐敗菌為希瓦氏菌、肉食桿菌、陰溝腸桿菌的結(jié)論也稍有不同，這說明即使是同一種水產(chǎn)品，其優(yōu)勢腐敗菌也會(huì)因產(chǎn)地和貯藏溫度的影響而發(fā)生變化。
3結(jié)論
本研究對產(chǎn)地為武漢孝感的冷藏小龍蝦中優(yōu)勢腐敗菌進(jìn)行篩選鑒定，并對小龍蝦貯藏過程中微生物結(jié)構(gòu)變化及多樣性進(jìn)行分析。傳統(tǒng)培養(yǎng)法從冷藏小龍蝦中共篩選出維氏氣單胞菌、波羅的海希瓦氏菌、普通變形桿菌等10株細(xì)菌，結(jié)合高通量測序結(jié)果，最終確定小龍蝦中主要優(yōu)勢腐敗菌為氣單胞菌屬和希瓦氏菌屬。同時(shí)，高通量測序結(jié)果表明，小龍蝦在貯藏過程中微生物結(jié)構(gòu)一直在變化。某些細(xì)菌數(shù)量逐漸減少，如在鮮樣期（0 d）小龍蝦中相對豐度較大的細(xì)菌叢毛單胞菌屬在腐敗末期小龍蝦中相對豐度小于1%。而氣單胞菌屬、希瓦氏菌屬相對豐度在貯藏過程中一直增大，并最終占據(jù)腐敗小龍蝦中微生物的主導(dǎo)地位。在腐敗末期，氣單胞菌屬、希瓦氏菌屬、變形桿菌屬、不動(dòng)桿菌屬、檸檬酸桿菌屬、巨球菌屬6種菌屬的總相對含量為85%以上。α-多樣性分析表明，小龍蝦鮮樣期OTU數(shù)量最多，菌群群落結(jié)構(gòu)豐富度、多樣性及均勻度最高。而隨著貯藏時(shí)間的增長，多樣性、豐富度及均勻度都在下降，尤其是在腐敗末期到達(dá)最低，這可能與優(yōu)勢腐敗菌的大量繁殖及繁殖過程中對其他細(xì)菌生長的抑制有關(guān)。β-多樣性分析則表明，鮮樣期與腐敗末期菌群結(jié)構(gòu)差異較大，而腐敗中期與腐敗末期差異較小，這與α-多樣性分析結(jié)果相一致。對冷藏小龍蝦優(yōu)勢腐敗菌的篩選鑒定、細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性分析，為今后利用保鮮技術(shù)靶向殺滅腐敗菌、延長貨架期、降低經(jīng)濟(jì)損失提供了一定的理論參考，同時(shí)也為今后開發(fā)新的小龍蝦品質(zhì)安全檢測及保鮮殺菌技術(shù)提供了思路。
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