基于生長速率法優(yōu)化放線菌發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件（二）
1.2.3菌株發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化及發(fā)酵條件優(yōu)化
（1）菌株發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化。將11種不同的液體培養(yǎng)基各100 mL分別添加至250 mL錐形瓶中，然后加入種子液發(fā)酵，參照1.2.2-(3)的方法測定抑菌活性，篩選出最優(yōu)的培養(yǎng)基作為后續(xù)試驗的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。
采用單因素試驗法，在篩選出的基礎(chǔ)培養(yǎng)基上，以葡萄糖、大米、小米、玉米面、蔗糖、燕麥、麥芽糖、淀粉、乳糖、甘露醇作為碳源；以酸水解酪蛋白胨、牛肉膏、大豆蛋白胨、硫酸銨、酵母膏、胰蛋白胨、大豆粉、魚蛋白胨、麥芽粉、蛋白胨作為氮源，參照1.2.2-(3)的方法測定抑菌活性，篩選出3種較好的氮源和碳源。
利用交叉組合試驗，將篩選出的3個碳源和3個氮源進(jìn)行交叉組合，確定最優(yōu)的碳源和氮源組合，參照1.2.2-(3)的方法進(jìn)行抑菌活性測定，得到最優(yōu)碳氮源組合。
以最優(yōu)碳氮源組合固定碳源或氮源，將氮源或碳源濃度分別設(shè)置為5、10、15、20、25、30、35、40 g/L，參照1.2.2-(3)的方法測定抑菌活性，確定最優(yōu)碳源、氮源濃度為最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基配方。
（2）菌株發(fā)酵條件的優(yōu)化。在最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基下，優(yōu)化菌株的發(fā)酵條件。采用單因素試驗，分別選擇不同的發(fā)酵初始pH：5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0；不同的發(fā)酵時間：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 d；不同的接種量：1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%；250 mL錐形搖瓶中不同的裝液量：75、100、125、150、175、200 mL。參照1.2.2-(3)的方法測定抑菌活性，確定最優(yōu)發(fā)酵初始pH、發(fā)酵時間、接種量和裝液量。
1.3數(shù)據(jù)處理
采用Excel 2019軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，采用IBM SPSS Statistics 27軟件進(jìn)行顯著性分析。
2結(jié)果與分析
2.1形態(tài)學(xué)觀察
在ISP3培養(yǎng)基上，放線菌R2A-77單菌落形態(tài)呈圓形，氣生菌絲生長繁茂，產(chǎn)生密集孢子堆，菌落呈現(xiàn)灰棕色。通過掃描電鏡觀察可知，菌株菌絲眾多，孢子鏈伸展，形狀為長圓形。
放線菌R2A-77菌株在不同鑒定培養(yǎng)基上的生長存在明顯差異，其氣生菌絲、基內(nèi)菌絲的生長狀況等方面均有差異，在ISP1、ISP2、ISP6、ISP7培養(yǎng)基上產(chǎn)生可溶性黃色色素，在ISP1、ISP3、R2A、MS培養(yǎng)基上生長旺盛。
相較于其他培養(yǎng)基，放線菌R2A-77菌株在MS培養(yǎng)基上的生長狀況較好，菌落顏色為灰白色，形狀為圓形，菌落易挑起，氣生菌絲呈灰白色，基內(nèi)菌絲呈乳黃色，無可溶性色素。因此，確定放線菌R2A-77菌株的最適生長培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基。
2.2生理生化特征
放線菌R2A-77菌株在37℃時生長狀態(tài)最佳，低于19℃和高于40℃時菌株停止生長。NaCl的濃度為0%時，生長狀態(tài)最佳，培養(yǎng)4 d便有大量孢子覆蓋于菌落表面，形成表面干燥、凸起、灰白色的圓形菌落；NaCl濃度為0%~1%時菌株生長，2%時完全停止生長。菌株在pH為5.0~12.0時均能生長，且pH為5.0時菌落較大，產(chǎn)孢子豐富，生長狀況最佳。
放線菌R2A-77菌株可使明膠液化，可產(chǎn)過氧化氫酶，但無法使牛奶凝固或胨化，同時也不產(chǎn)硫化氫和黑色素。
2.3 16S rRNA基因測序結(jié)果
通過序列測定，放線菌R2A-77菌株的16S rRNA基因長度為1446 bp，且完整性為99.8%。通過EzBioCloud平臺對放線菌R2A-77菌株進(jìn)行16S rRNA基因序列比對，與該菌株高度同源的菌株均來自鏈霉菌屬（Streptomyces）。其中，與放線菌R2A-77最相似的菌株為S.salinarius SS06011，相似度為99.93%，其GenBank登錄號為LC430995。
基于16S rRNA基因序列建立系統(tǒng)發(fā)育樹中，經(jīng)過1000次聚類，菌株與S.salinarius SS06011進(jìn)化關(guān)系最近。經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特征檢測，結(jié)合16S rRNA序列測序與系統(tǒng)進(jìn)化分析，確定放線菌R2A-77為鏈霉菌（Streptomyces）。
2.4放線菌R2A-77菌株發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化
2.4.1基礎(chǔ)培養(yǎng)基
通過對11種不同的液體培養(yǎng)基發(fā)酵液進(jìn)行抑菌活性測定，結(jié)果表明，放線菌R2A-77菌株在不同的發(fā)酵培養(yǎng)基中的抑菌活性具有一定差異，在MS培養(yǎng)基中的抑菌活性最優(yōu)，指狀青霉生長圈平均直徑為20.54 mm?；诖?，選定MS培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基。
2.4.2碳源
以MS培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別采用10種不同碳源進(jìn)行抑菌活性測定。結(jié)果表明，在以玉米面、蔗糖、淀粉為碳源發(fā)酵液中，指狀青霉生長圈平均直徑分別為16.58、16.37、16.79 mm，具有較強的抑菌活性，因此選用玉米面、蔗糖、淀粉作為進(jìn)一步研究的碳源。
2.4.3氮源
以MS培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別采用10種不同氮源進(jìn)行抑菌活性測定。結(jié)果表明，以大豆蛋白胨、大豆粉、蛋白胨為氮源的發(fā)酵液中，指狀青霉生長圈平均直徑分別為11.20、22.10、24.24 mm，具有較強的抑菌活性，因此選用大豆蛋白胨、大豆粉、蛋白胨作為進(jìn)一步研究的氮源。
2.4.4碳源與氮源組合
根據(jù)篩選的氮源和碳源對放線菌R2A-77菌株進(jìn)行交叉組合發(fā)酵培養(yǎng)。結(jié)果表明，蔗糖+大豆蛋白胨組合的發(fā)酵液表現(xiàn)出最優(yōu)的抑菌活性，指狀青霉生長圈平均直徑為10.87 mm；蔗糖+大豆粉組合的抑菌活性次之，指狀青霉生長圈平均直徑為16.54 mm。因此確定蔗糖與大豆蛋白胨作為放線菌R2A-77菌株發(fā)酵的最優(yōu)氮源、碳源組合。
2.4.5碳源與氮源濃度
基于最優(yōu)碳源、氮源組合，將碳源和氮源濃度分別設(shè)置為10個不同濃度梯度對放線菌R2A-77菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。結(jié)果表明，碳源濃度為10 g/L時，發(fā)酵液的抑菌活性最優(yōu)，指狀青霉的生長圈平均直徑為9.07 mm；氮源濃度為35 g/L時，發(fā)酵液的抑菌活性最優(yōu)，指狀青霉生長圈平均直徑為9.46 mm。因此碳源濃度選用10 g/L，氮源濃度選用35 g/L。
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