不同保存條件、培養基對淋病奈瑟菌存活率的影響——結果、討論
二、結果
1.7種淋球菌選擇性培養基的初步評估：1號淋球菌在自制培養基及7種商品化培養基上均能密集生長；2號淋球菌在7種商品化培養基中的生長均不如自制培養基；自制培養基及巧克力平板（淋球菌）、MTM瓊脂平板、一次性GC瓊脂培養基及淋球菌瓊脂平板均能完全抑制黏液奈瑟菌的生長；自制培養基對糞腸球菌生長的抑制效果較差，淋球菌（T-M）選擇培養基能完全抑制糞腸球菌的生長；混合菌在自制培養基及淋球菌分離培養板、淋球菌（T-M）選擇培養基、巧克力平板（淋球菌）、MTM瓊脂平板及一次性GC瓊脂培養基等培養基上分離效果較好，呈現淋球菌菌落大、雜菌小或無雜菌。5株淋球菌質控菌株在7種商品化的淋球菌選擇性培養基與自制淋球菌選擇性培養基培養的結果見表1。
| 培養基 | 1號淋球菌 | 2號淋球菌 | 黏液奈瑟菌 | 糞腸球菌 | 混合菌* |
|---|---|---|---|---|---|
| 自制淋球菌選擇性培養基 | 菌落較大,無色半透明,1區++++,3區分出單個菌落 | 菌落較大,無色半透明,1區+++,3區分出單個菌落 | - | 灰白色,++++,3區分出單個菌落 | 淋球菌大,雜菌小,2、3區分出單個菌落 |
| 淋球菌分離培養板 | 菌落較小,無色半透明,1區+++,3區分出單個菌落 | 菌落較小,無色半透明,1區++,2區分出單個菌落 | + | 較透明,++++,3區分出單個菌落 | 淋球菌大,雜菌小,2、3區分出單個菌落 |
| 淋球菌(T-M)選擇培養基 | 菌落較小,無色半透明,1區+++,3區分出單個菌落 | ++,2區分出單個菌落 | ++ ~ +++ | - | 純淋球菌,無雜菌 |
| 巧克力平板(淋球菌) | 菌落較小,無色半透明,1區+++,3區分出單個菌落 | ++,2區分出單個菌落 | - | ++++,3區分出單個菌落 | 淋球菌大,雜菌小,2、3區分出單個菌落 |
| 淋球菌選擇培養基 | 菌落較小,無色半透明,1區+++,3區分出單個菌落 | ++,2區分出單個菌落,3區2個菌落 | ++ | ++++,3區分出單個菌落 | 淋球菌小,雜菌大,2、3區分出單個菌落 |
| MTM瓊脂平板 | 菌落較大,灰白色,1區+++,3區分出單個菌落 | ++,2、3區分出單個菌落 | - | ++++,3區分出單個菌落,有溶血環 | 2區分出單個淋球菌,3區無淋球菌,只有雜菌 |
| 一次性GC瓊脂培養基 | 菌落較小,無色半透明,1區+++,3區分出單個菌落 | ++,2、3區分出單個菌落 | - | ++++,3區分出單個菌落 | 淋球菌大,雜菌小,2、3區分出單個菌落 |
| 淋球菌瓊脂平板 | 菌落較小,無色半透明,1區+++,3區分出單個菌落 | ++,2、3區分出單個菌落 | - | ++ | 菌落較小,1區3個雜菌,2、3區無雜菌 |
| 注:生長情況,“+”:1~10個菌落(稀疏生長);“++”:11~100個菌落(中等生長);“+++”:>100個菌落,但未融合(密集生長);“++++”:菌落融合成片(無法計數);-:無菌生長。“混合菌,含1株淋球菌(編號ATCC49226)和1株糞腸球菌(編號ATCC29212) | |||||
2.CO?依賴型淋球菌的篩選：在CO?環境下，16株淋球菌均呈現出良好的生長狀態（菌落融合成片）。無CO?條件下，11株的生長受到明顯抑制，表現為菌落數量顯著減少或無菌落生長；5株（ATCC49226、WHOG、NJ08-94、NJ08-112、NJ08-118）在無CO?環境下仍有一定數量的菌落，但數量明顯少于有CO?環境下的生長結果。
3.4種保存液保存淋球菌的效果觀察：淋球菌在4種保存液中-70℃保存1周至12個月，培養菌落均融合成片，保存效果未見差異。在-20℃條件下，不同保存液的性能可存明顯，30%甘油胰酶大豆肉湯保存效果最好，3個月時可存活，6個月時仍有少數存活；其次為20%甘油腦心浸液，3個月時可存活；10%甘油小牛血清保存1個月時僅部分存活；10%二甲基亞砜小牛血清保存效果最差，2周時僅部分存活。
4.淋球菌不同保存方法的效果：未凍干的淋球菌在4℃、-18℃、-29℃、-70℃和液氮下的保存時間存在差異，4℃保存4 d即無淋球菌存活；-18、-29℃下，1個月時僅分別見10、12個菌落；在-70℃和液氮中保存6個月仍可存活（菌落融合成片）。凍干后的淋球菌在4℃、-18℃、-29℃、-70℃保存6個月仍可存活（菌落融合成片），25℃可保存1個月，37℃可保存3 d（菌落融合成片）。
三、討論
目前淋球菌的檢測方法主要有直接鏡檢法、分離培養法和核酸擴增檢測法等，分離培養法仍是淋球菌檢測的“金標準”，且可同時進行淋球菌耐藥實驗。高質量的淋球菌選擇性培養基是臨床獲得分離淋球菌成功的至關重要因素之一。目前常用的淋球菌培養基通過添加抗生素抑制雜菌的生長，但部分種類的抗生素（如萬古霉素）對淋球菌生長也有影響。本研究中淋球菌在7種商品化培養基中生長存在差異，不排除其他抗生素引起的淋球菌生長受到抑制。
混合菌主要用于驗證淋球菌選擇性培養基對雜菌的抑制能力以及實驗技術人員對淋球菌的分離鑒定能力。不同種類淋球菌選擇性培養基對雜菌的抑制能力各不相同，直接干擾實驗技術人員對淋球菌的分離鑒定水平[4]。此外，隨著淋球菌耐藥菌株的不斷出現，對淋球菌培養基的配方提出了更高的要求，商品化的淋球菌培養基質量有待進一步提高。
燭缸培養是一種簡單、經濟的培養方法，尤其適用于資源受限的偏遠及基層醫療機構[5]。無論淋球菌參考菌株還是臨床分離株，都需依賴一定量的CO?環境才能生長，只有極少數淋球菌在培養時不依賴CO?的環境[3]。因此，在開展淋球菌培養時，需確保培養成本放入燭缸后的密閉性，以免影響淋球菌的培養結果，造成假陰性。
淋球菌是一種苛養菌，其營養要求高，培養和保存較難。對于淋球菌的長期保存，建議使用-70℃條件下的任何一種保存液，尤其是20%甘油腦心浸液，其在-20℃下也有較好的保存效果。對于基層醫療單位在實驗室條件有限的情況下，30%甘油胰酶大豆肉湯是比較實用的保存方法。本次研究只對淋球菌少量參考菌株和臨床分離株進行了保存效果觀察，對于淋球菌大樣本的保存效果仍需要進一步研究。
菌種保存方法有多種，如固體培養基保存法、半固體穿刺保存法、干燥保存法及超低溫保存等[6]。理想的菌種保存不僅要維持菌株的活性，還需確保菌株固有的生物學性狀及抗原特性。淋球菌對外界理化因子的抵抗力較弱，對熱敏感，易產生自溶酶。常規的固體培養基需定期傳代，操作較為煩瑣并易導致菌株突變[7]，目前冷凍干燥法是淋球菌保存運輸的最佳方法。對于未凍干菌株，-70℃或液氮是更優的選擇；而凍干菌株在多種低溫條件下均能較好保存。本研究顯示淋球菌凍干后保存要優于未凍干狀態保存。
綜上所述，本研究主要比較淋球菌商品化培養基與自制培養基的性能、篩選CO?依賴型菌株、評估4種自制保存液對淋球菌的保存效果以及淋球菌在凍干前后的存活情況。結果表明，淋球菌的分離培養在自制培養基及一定量的CO?環境下能較好生長，30%甘油腦心浸液保存淋球菌的效果要優于其他保存液，超低溫及凍干后保存可以提高其存活時間。本次評估僅局限于本實驗室，為確保實驗結果的可重復性，未來在研究開展前應進行重復性設計并做預試驗，實驗操作人員應熟練掌握操作流程、遵循安全規范、及時詳細記錄實驗數據等，有條件可以開展多中心評估。
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