基于ELISA和細(xì)菌生長(zhǎng)曲線應(yīng)用的結(jié)合定量檢測(cè)腸炎沙門氏菌（二）
2結(jié)果
2.1 vidas檢測(cè)值與菌濃度關(guān)系及驗(yàn)證
本文發(fā)現(xiàn)，Vidas測(cè)試值與沙門氏菌濃度(對(duì)數(shù)值)函數(shù)關(guān)系為y=0.102x3-0.648x2+1.563x+5.826，相關(guān)系數(shù)R2=0.994，X值適應(yīng)范圍0.2～3.8，對(duì)應(yīng)沙門氏菌濃度范圍約106～108cfu/ml，即vidas對(duì)沙門氏菌檢測(cè)底限約在106cfu/ml，而菌濃度超過108cfu/ml會(huì)出現(xiàn)x值鈍化狀態(tài)，可能與抗原抗體結(jié)合飽和有關(guān)。取經(jīng)過一系列稀釋梯度的腸炎沙門氏菌液6管分別對(duì)其進(jìn)行vidas檢測(cè)和使用3 M測(cè)試片計(jì)數(shù)進(jìn)行了驗(yàn)證試驗(yàn)。通過驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，vidas檢測(cè)計(jì)算值與測(cè)試片所得值相對(duì)誤差最小0.13%，最大2.50%，平均相對(duì)誤差1.33%。見圖1、表1。
2.2腸炎沙門氏菌在TTB和SC中生長(zhǎng)曲線的建立
我們比較腸炎沙門氏菌若干梯度在sc增菌液36℃培養(yǎng)生長(zhǎng)曲線發(fā)現(xiàn)，生長(zhǎng)曲線對(duì)數(shù)期的中后期培養(yǎng)8～10 h是進(jìn)行vidas檢測(cè)較好時(shí)機(jī)，而vidas最佳檢測(cè)區(qū)間在沙門氏菌濃度在106cfu/ml到108cfu/ml，這時(shí)各梯度生長(zhǎng)曲線區(qū)分度分較好，進(jìn)入平穩(wěn)期曲線則近于粘合。橫坐標(biāo)為培養(yǎng)時(shí)間(h)縱坐標(biāo)我們發(fā)現(xiàn)腸炎沙門氏菌在TTB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)曲線的對(duì)數(shù)期要短些，培養(yǎng)12 h后基本進(jìn)入穩(wěn)定期。其中接種1 cfu/ml為例經(jīng)過2 h的調(diào)整期進(jìn)入對(duì)數(shù)期，經(jīng)過約14 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，不同接種濃度沙門氏菌在調(diào)整期都是2 h，不同的是濃度越高對(duì)數(shù)期時(shí)間越短更早的進(jìn)入穩(wěn)定期。見圖2、3。
圖1 Vidas測(cè)試值橫坐標(biāo)與菌濃度縱坐標(biāo)(取對(duì)數(shù)值)函數(shù)關(guān)系
表1驗(yàn)證試驗(yàn)中通過vidas檢測(cè)得到數(shù)值代入公式計(jì)算值與實(shí)測(cè)值對(duì)比分析
圖2腸炎沙門氏菌若干稀釋梯度在SC增菌液36度培養(yǎng)生長(zhǎng)曲線
圖3腸炎沙門氏菌若干稀釋梯度在TTB增菌液42度培養(yǎng)生長(zhǎng)曲線
2.3通過生長(zhǎng)曲線對(duì)人為污染樣品的檢測(cè)本文發(fā)現(xiàn)，在SC增菌液中，冷鮮豬肉模擬樣品相對(duì)誤差較大，其余樣本誤差均在10%以內(nèi);在TTB增菌液中，冷鮮豬肉模擬樣品相對(duì)誤差在28.6%，而其他樣本誤差均在10.0%以內(nèi)。見表2～5。
2.4干擾實(shí)驗(yàn)本文發(fā)現(xiàn)，干擾試驗(yàn)中對(duì)含有干擾菌的樣品檢測(cè)與不含干擾菌的檢測(cè)誤差平均值為0.17，相對(duì)誤差平均值在11.0%。見表6。
表2加入系列濃度沙門氏菌的人為污染樣品在sc增菌液中增菌9 h后vidas檢測(cè)
表3實(shí)際添加腸炎沙門氏濃度和檢測(cè)值比較分析%
表6第1組樣品和第2組添加干擾菌的樣品的增菌液初始沙門氏菌濃度估算cfu/ml
3討論
沙門氏菌是影響食品安全的主要微生物之一。沙門氏菌病是公共衛(wèi)生學(xué)上重要的人畜共患病之一，沙門氏菌引起的食物中毒在各國(guó)細(xì)菌性食物中毒中常列榜首，現(xiàn)有規(guī)定中食品中不得檢出沙門氏菌［6，7］。但是目前食品中沙門氏菌的定量檢測(cè)方法相對(duì)較少，且存在諸多的不足。本課題對(duì)鮮肉及制品中腸炎沙門氏菌定量檢測(cè)研究，基于沙門氏菌在選擇性增菌液中的生長(zhǎng)曲線。選擇性增菌液對(duì)干擾菌會(huì)有一定的抑制作用，同時(shí)還能促進(jìn)沙門氏菌的生長(zhǎng)，這樣能夠更好的對(duì)目標(biāo)菌的分離。通過生長(zhǎng)曲線可以看出，無論接種濃度大小，都經(jīng)歷2 h停滯期(適應(yīng)期)然后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期隨著接種菌濃度增加而縮短，進(jìn)過培養(yǎng)9～16 h不同接種濃度沙門氏菌基本上都到達(dá)平穩(wěn)期菌含量在(5～8)×108cfu/ml。在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期不同接種濃度沙門氏菌形成斜率基本相同的平行斜線，如在SC增菌液中對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)曲線斜率在0.71～0.73。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期某一定時(shí)間不同接種濃度的沙門氏菌增殖達(dá)到濃度形成一定斜率的直線，如SC增菌中培養(yǎng)9 h時(shí)得出方程y=1.028X-5.202相關(guān)系數(shù)R2=0.995，根據(jù)此方程和此時(shí)增菌液沙門氏菌濃度x可以計(jì)算出增菌液初始接種濃度。本文中使用vidas對(duì)增菌液濃度檢測(cè)根據(jù)檢測(cè)值與菌濃度數(shù)學(xué)模型y=0.102x3-0.648x2+1.563x+5.826相關(guān)系數(shù)R2=0.994(0.2＜x＜3.8)因?yàn)関idas檢測(cè)底限在106cfu/ml此時(shí)檢測(cè)值接近0.2，此方法在10 h時(shí)檢測(cè)限在2 cfu/ml附近。但是如果使用熒光定量PCR檢出限100 cfu/ml，能夠定量到1 cfu/100 ml［8-10］。
本方法是對(duì)鮮肉類及制品直接使用SC或TTB增菌根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)SN/T0040-1992出口食品沙門氏菌屬(包括亞利桑那菌)計(jì)數(shù)檢驗(yàn)方法。本使用腸炎沙門氏菌為模型進(jìn)行的研究，如果擴(kuò)展到其他類型沙門氏菌還需要具體探索其他菌在SC或TTB中的生長(zhǎng)模型。同時(shí)，本文探索基于ELISA-生長(zhǎng)曲線原理來對(duì)沙門氏菌定量研究的方法，也可擴(kuò)展到對(duì)其他菌的定量研究。
基于ELISA和細(xì)菌生長(zhǎng)曲線應(yīng)用的結(jié)合定量檢測(cè)腸炎沙門氏菌（一）
基于ELISA和細(xì)菌生長(zhǎng)曲線應(yīng)用的結(jié)合定量檢測(cè)腸炎沙門氏菌（二）
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