菌株雙控制生長開關及其應用的遺傳穩定性（一）
代謝工程和合成生物學為將細菌轉化為生物工廠，從廉價的底物中生產有價值的化合物提供了廣泛的可能性。用于生物生產的微生物工程相當于代謝通量從生長到產品合成的重新定位。這種細胞資源的重新分配面臨著產量和生產力之間的基本權衡。產量的增加，即底物轉化為產物的比例，會增加代謝負荷，從而降低生長速率。較低的生長速率導致較慢的生物量積累，并因此降低生產率，即降低感興趣的化合物的總生產率。
處理這種權衡的一種廣泛使用的方法是交替生長和生產階段。沿著這些思路，研究人員在大腸桿菌中開發了一種合成生長開關，其中表達RNA聚合酶兩個主要亞單位β和β′的操縱子受到異丙基-b-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導型啟動子的嚴格調控。研究發現，通過調節誘導劑的外部濃度，可以開啟或關閉生長。此外，在生長停滯后，細菌能夠從葡萄糖中產生甘油，產量接近理論最大值。
從進化的角度來看，許多合成回路都是脆弱的，因為攜帶該回路的宿主菌株被其必須運行的環境反向選擇。這也適用于生長開關，即解除RNA聚合酶ββ’亞基編碼基因抑制的自發突變會導致生長中的突變細菌迅速超過生長停滯的細菌群。生長開關的設計包括防止突變發生的保護措施，特別是編碼阻遏物LacI的基因的冗余。然而，當在大規模生物反應器中進行高密度培養的長時間發酵過程時，有害的突變體發生的概率更高，并且這些保護措施可能是不夠的。在大腸桿菌中，突變率約為每代每核苷酸2×10-10，這意味著在高細胞密度下，平均幾次細胞分裂就足以使任何核苷酸突變。
通過建立進一步的冗余，可以控制RNA聚合酶表達的合成回路的遺傳穩定性的進一步增加。在這里，研究人員開發了一種菌株，其中RNA聚合酶的另一個亞單位α被置于用于控制ββ’亞單位表達的同一lac系統的控制之下。因此，只有編碼α(rpoA)和ββ′(rpoBC)的基因上游的兩個啟動子區域同時突變，才能使RNA聚合酶的表達控制失效，從而使生長控制失效。這顯著增加了生長開關及其應用的遺傳穩定性。
研究內容：
1.RNA聚合酶表達雙調控大腸桿菌菌株的構建
圖1生長開關的交替設計：單控制（SC）和雙控制（DC）
研究人員首先將編碼β和β‘亞基的rpoBC基因置于一個可誘導啟動子的控制下，來控制RNA聚合酶的表達。利用同源重組將天然啟動子替換為T5啟動子、兩個lac操作子和大觀霉素抗性。轉錄調控因子LacI與lac操縱序列結合，從而阻止RNA聚合酶轉錄rpoBC基因。當IPTG結合時，LacI與操縱符序列分離，從而緩解了基因的抑制。rpoBC基因也與核糖體基因rplKAJL一起被組織成一個操縱子。為了避免控制rplKAJL表達的啟動子的通讀轉錄，因此在大觀霉素抗性基因的上游添加了一個強終止子（圖1a）。
使用上述系統，可以通過IPTG外部控制RNA聚合酶的表達。當在培養基中添加IPTG時，會產生ββ‘-亞基，細菌正常生長。然而，在沒有IPTG的情況下，rpoBC基因不被轉錄，也沒有形成新的RNA聚合酶全酶。因此，細胞產生生物合成功能所需的RNA和蛋白質的能力下降，并最終停止生長。然而，這些細菌仍然具有代謝活性，可以利用它來引導營養物質從生長到產生一種感興趣的化合物。
這種方法的一個缺點是，LacI基因的突變會阻止抑制因子與T5啟動子區域結合，在生長停滯的條件下是非常有益的，因為有豐富的營養物質，但沒有IPTG供應。攜帶這些突變的細菌能夠在這些條件下生長，并將很快超過培養物。為了使生長開關對突變更穩定，因此在染色體上的不同位點上克隆了另外兩個lacI拷貝（圖1b）。這種冗余降低了由于lacI突變而失去生長控制的風險。這種策略導致了一個至少能穩定24小時的系統。
為了滿足這一要求，研究人員進一步推進了冗余策略，將α-亞基基因置于第二個相同的T5啟動子的控制下。α-亞基由rpoA基因編碼，rpoA基因包含在核糖體基因rpsMKD和rplQ的操縱子中。與rpoBC基因相反，rpoA沒有一個單獨的啟動子，并與核糖體基因共轉錄。為了避免核糖體基因的表達受到干擾，研究人員將rpoA克隆到sokA-insKJ-hokA序列中，用氯霉素抗性取代了rpoA的自然拷貝（圖1c，d）。
2.RNA聚合酶表達的雙重控制導致了一個功能性的生長開關
SC菌株表現出一種開關樣的誘導模式:對于低濃度的IPTG，菌株不生長，而高于閾值濃度，菌株的生長速度與WT菌株大致相同。為驗證在DC菌株中實現的ββ'‐和α‐亞基誘導控制的改進設計是否保留了這種開關表型。研究人員將SC和DC菌株在M9最小培養基中預培養，添加0.2%葡萄糖和250μM IPTG，以保證RNA聚合酶的表達和生長。將預培養物洗滌并重新稀釋到相同的培養基中，但添加了不同濃度IPTG，范圍為0至500μM。
在SC應變的曲線中，0-20μM的IPTG中，由于預培養中RNA聚合酶的積累，有一些殘留的生長，當RNA聚合酶被稀釋后停止。然而，吸光度仍然可以忽略不計。相反，當濃度為40μM或更高時，rpoBC的誘導足以使菌株生長，其速度與WT菌株相似。為了量化這一觀察結果，研究人員確定了生長培養物在指數中期的生長速率，并將生長受阻的菌株的生長速率設置為0（圖2c）。該圖清楚地顯示出了SC應變在IPTG閾值濃度附近的開關行為。
DC菌株也表現出一個開關表型，具有近似相同的開關閾值，盡管在40μM時，尚未達到最大的生長速率（圖2b）。此外，其最大生長速率低于WT菌株。DC的生長產量，即限制碳源（0.2%葡萄糖）產生的最大生物量，也低于WT菌株，這與SC菌株的觀察結果相反（圖2a，b）
圖2單調控（SC）和雙調控（DC）菌株的生長開關行為
這兩種菌株的不同設計可以解釋SC菌株和DC菌株轉換表型的差異。對于高IPTG水平，SC中β‘-亞基的濃度高于WT菌株。因為rpoB和rpoC以大約相同的速率共轉錄和翻譯，這可能也適用于β-亞基。因此，在SC菌株中，功能核心RNA聚合酶的濃度將受到高IPTG水平下（自然表達的）α-亞基的濃度的限制。然而，在DC菌株中，rpoA也是從T5啟動子轉錄出來的（并且與rpoB具有相同的核糖體結合位點）。考慮到ω-亞基是非必需的，因此，對于高水平的IPTG，DC中功能核心RNA聚合酶的濃度高于SC中。這可能導致不必要的更高的轉錄活性，導致適應度成本，從而導致生長缺陷。
相關新聞推薦
1、基于革蘭氏陽性菌生長曲線等指標評價纖維素基抑菌材料L-Met改性MCC（M-MCC）抑菌效果（五）
2、PlcR在炭疽芽胞桿菌A16R中對其生長狀態、溶血酶活性及神經磷脂酶活性影響（一）