土霉素菌渣無害化處理：篩選菌株的生長曲線及產蛋白酶條件（一）
2.5.2培養溫度對菌株產蛋白酶能力的影響
向100 mL/250 mL察氏培養基中，分別接入1 mL M-1、M-2孢子懸液，pH值為6.5，培養溫度分別設置為25℃、30℃、35℃、40℃、45℃，平行3組。在轉速為160 r/min條件下培養168 h，分別取樣，測定酶活，考察溫度的變化對產酶活性的影響，結果如圖6。
圖6培養溫度對菌株產酶的影響
在30℃以下培養時，菌株M-1和M-2產生蛋白酶活力隨著溫度的升高而增大，溫度達到30℃時，它們酶活力均達到最高，而后隨溫度的提高酶活力下降。因此，菌株M-1和M-2產蛋白酶的最適溫度確定為30℃。
2.5.3培養時間對菌株產酶的影響
分別向100 mL/250 mL察氏培養基中接入1 mL M-1孢子懸液、1 mL M-2孢子懸液，pH值為6.5，平行3組。在30℃轉速為160 r/min條件下培養192 h。每隔24 h分別取樣測定酶活，考察培養時間對產酶活性的影響，結果如圖7。
圖7培養時間對菌株產酶的影響
培養到48 h時，菌株M-1、M-2均開始產蛋白酶，培養至72 h時，酶積累量開始增大。在168 h時M-1產酶活力達到最高值，而M-2在144 h時酶活達到最高；在最高點之后，兩種菌的產酶活性隨之緩慢下降。因此，菌株M-1和M-2產蛋白酶的最適培養時間分別確定為168 h和144 h。
2.5.4菌渣添加量對菌株產蛋白酶能力的影響
分別在100 mL/250 mL蒸餾水中加入5、10、15、20、25 g的400目土霉素菌渣粉末，分別向其中接入1 mL M-1、M-2孢子懸液，平行3組。在pH 6.5，轉速為160 r/min，30℃條件下培養144 h，分別測定酶活，考察菌渣添加量對產酶活性的影響，結果如圖8。
圖8菌渣添加量對菌株產酶的影響
菌渣添加量為5%～10%，M-1產蛋白酶的活力隨菌渣添加量的增大而增加，10%達到最高。M-2產蛋白酶活力在5%時達到最高，在10%時也保持了較高的酶活力。隨后，兩種菌的酶活力隨著菌渣添加量的增大而快速下降。在菌株M-1和M-2產蛋白酶的培養基中添加過多菌渣不利于其產生蛋白酶，這可能是菌渣中的一些成分影響了菌的產酶活性。所以，菌株M-1和M-2在菌渣培養基產蛋白酶的最適菌渣添加量分別確定為10%和5%。
2.5.5接種量對菌株產蛋白酶能力的影響
在100 mL/250 mL 5%的菌渣培養基中，分別接種1、3、5、7和9 mL的M-1、M-2孢子懸液，平行3組。在pH 6.5，轉速為160 r/min，30℃條件下培養144 h，分別取樣測定酶活，考察接種量對產酶活性的影響，結果如圖9。
圖9接種量對菌株產酶的影響
菌株M-1的產蛋白酶活力隨接種量的提高而增加，直至接種量為5 mL時其酶活力達到最高值，隨后其產酶活力逐漸下降，這可能是因為增加初始菌體的量導致菌體生長加快、發酵周期縮短。菌株M-2開始時，隨著接種量的加大其蛋白酶活力逐漸增加。所以，菌株M-1和M-2在菌渣培養基中產蛋白酶的最適接種量分別確定為5%和9%。
2.5.6裝液量對菌株產蛋白酶能力的影響
在250 mL的錐形瓶中分別加入5%的菌渣培養基20、40、60、80和100 mL，分別按照5%和9%的接種量接入M-1、M-2的孢子懸液，平行3組。在pH 6.5，轉速為160 r/min，30℃條件下培養144 h，分別取樣測定酶活，考察裝液量對產酶活性的影響，結果如圖10。
圖10裝液量對菌株產酶的影響
菌株M-1在裝液量低于40 mL時，其產生蛋白酶活力隨裝液量的加大而增加，在裝液量為40 mL時酶活達到最高，而后其酶活下降。菌株M-2的產蛋白酶活力隨著裝液量的增加而逐漸提高。所以，在250 mL錐形瓶中，M-1、M-2的最佳裝液量確定為40 mL和100 mL。
2.6菌株在優化菌渣培養條件下的產蛋白酶活力測定
M-1的優化培養條件：在250 mL錐形瓶中，40 mL裝液量，10%菌渣添加量，5%接種量，pH值6.0，30℃，搖床轉速160 r/min培養168 h；M-2的優化培養條件：在250 mL錐形瓶中，100 mL裝液量，5%菌渣添加量，9%接種量，pH值6.5，30℃，搖床轉速160 r/min培養144 h。發酵結束后，測定蛋白酶活力。結果見表1。
表1篩選菌株產蛋白酶活力
在菌渣培養基中，菌株M-2在其最適產酶條件下，發酵上清液中蛋白酶活為44.41 u/mL，菌株M-1在其最適產酶條件下產蛋白酶活性達到99.33 u/mL，比菌株M-2的高出1.24倍。
2.7篩選菌株對土霉素菌渣的轉化
篩選菌株對菌渣成分的轉化研究中，共考察了菌渣總重量、蛋白成分的變化和發酵后游離氨基酸的變化等內容，結果見表2。
表2菌渣活性成分的變化
菌株M-1和M-2在菌渣培養基中進行發酵時，對菌渣成分能夠有效轉化；其中M-1對總物質的轉化率達到6.21%，其中對菌渣蛋白質成分轉化尤為明顯達到12.79%；菌渣經M-1發酵處理后其游離氨基酸含量有明顯的提升，由原來7.14 mg增加到222.07 mg，提高了30倍。結果表明，篩選菌株M-1在簡單的菌渣培養基中能很好地生長，而且對菌渣蛋白質有較好的水解和轉化活性。菌株M-2對菌渣總物質的轉化率達到2.4%，對菌渣蛋白質成分轉化達到3.65%，菌渣經M-2發酵處理后其游離氨基酸含量有較好的提升，由原來7.14 mg增加到49.26 mg，提高了6倍。經M-1處理后的菌渣所減少的質量大部分是蛋白質被轉化所致，而M-2處理后的菌渣減少的質量部分是轉化蛋白質，另外一部分是被水解的其他物質減少的量。
3結論
本實驗篩選出兩株M-1、M-2，經初步鑒定M-1為米曲霉菌，M-2為綠色木霉菌。M-1在pH 3、M-2在pH 6.5時生長量最大，均表現出良好的酸耐受性。兩株霉菌在土霉素濃度1 800 u/mL的條件下生長良好，具有較好的土霉素耐受性。菌渣pH值及土霉素殘留量對其生長沒有抑制作用，適合應用于土霉素菌渣的處理，對堿性環境耐受性較差。兩株霉菌對處理菌渣是有效的，M-1的處理效果好于M-2。M-1對菌渣蛋白質成分的轉化率達到12.79%，游離氨基酸含量提高了30倍；菌渣經M-2發酵處理后其游離氨基酸含量提高了6倍。
篩選菌株可在酸性的菌渣環境中生長，可對生產菌渣進行發酵處理，可以得到蛋白質水解液，用水解液部分替代土霉素生產發酵培養基的碳、氮源進行生產土霉素，可降低生產成本；同時達到菌渣的回收利用和無害化處理目的。對含大量抗生素殘留、成分復雜、難降解的危險污染物菌渣，目前還缺乏高效、節能、環境友好型的處理方法。土霉素菌渣中的蛋白質含量可達到43.88%，利用兩株霉菌生長及代謝的不同，如果實現兩種菌株的混合培養，作為互補進而加強對菌渣的處理能力，對危險菌渣的無害化處理及資源的再利用方面具有重大價值，這有待進一步研究。
土霉素菌渣無害化處理：篩選菌株的生長曲線及產蛋白酶條件（一）
土霉素菌渣無害化處理：篩選菌株的生長曲線及產蛋白酶條件（二）
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