新一代益生菌Akk在兩種培養基中的生長情況與差異性代謝組學分析結果（二）
2.3組間差異分析
本研究結合單變量統計分析和多維統計分析方法，篩選Akk在兩種培養基中的顯著性差異代謝物，對正、負離子模式下檢測到的顯著性差異代謝物進行分析。
單變量統計分析
在進行兩組樣本間的差異分析時，常用的單變量統計分析方法包括差異倍數（FC）分析、T檢驗/非參檢驗。基于單變量分析，對正、負離子模式下檢測到的所有代謝物（含未被鑒定的代謝物）進行差異分析，篩選出FC＞1.5或FC＜0.67，P＜0.05的差異代謝物共902種，其中正離子模式下670種，負離子模式下232種。將這些差異代謝物用火山圖的形式表示，結果如圖4所示。
如圖4所示，每個圓圈代表一個特定的代謝產物，優化后相對優化前，紅色為顯著上調的代謝產物（FC＞1.5，P＜0.05），藍色為顯著下調的代謝產物（FC＜0.67，P＜0.05），圓圈越靠近左右兩邊和上邊，差異性越顯著，黑色為非顯著性差異代謝物。之后研究均針對紅色和藍色圓圈代表的顯著性差異代謝物。
多維統計分析
多維統計分析可以從總體水平反映組間差異以及組內的變異度，常采用的方法包括PCA和OPLS-DA。將鑒定到的所有代謝物重新線性組合得到PCA模型，采用PCA方法，能從總體上反映樣本的總體分布趨勢和組件樣本的差異度。兩組樣本的PCA得分圖如圖5所示。
圖5中橢圓代表95%置信區間，同一顏色的點表示組內的各個生物學重復，由點的分布狀態可以看出，該模型可以區分兩組樣本，組間樣本的數據點很好地集中在一起。PCA模型參數R2X越接近1表明模型越可靠，正、負離子模式下的模型解釋率R2X分別為0.835和0.855。結果表明該模型穩定可靠，實驗重復性好，隨機誤差較小，可進一步對樣本進行差異性分析。
OPLS-DA得分圖及OPLS-DA置換檢驗如圖6所示，t[1]能最大程度反映組間差異，而to[1]則反映組內變異。可以看出OPLS-DA模型可顯著區分兩組樣本，且組內差異較小，結果與PCA模型一致。經7次循環交互驗證得到模型評價參數R2Y、Q2，通常情況下Q2＞0.5即表明模型穩定可靠。該模型正、負離子模式下的Q2分別為0.998、0.999，均大于0.5。在置換檢驗中，隨著置換保留度逐漸下降，隨機模型的R2和Q2均逐漸下降，說明原模型不存在過擬合現象，模型穩定性良好。
篩選差異代謝物
OPLS-DA模型得到的變量權重值（VIP）表示變量投影重要度，值越大，表示越重要。本實驗以VIP＞1和P＜0.05為顯著性差異代謝物的篩選標準，正離子模式下篩選到670種顯著性差異代謝物，負離子模式下篩選到232種顯著性差異代謝物，由于篩選到的差異代謝物過多，且表格無法直觀地顯示這些代謝物的FC，因此，選擇VIP值前50的差異代謝物，以柱狀圖形式展示鑒定到的顯著性差異代謝物的FC變化，結果如圖7所示。可以看出，與硫乙醇酸鹽液體培養基相比，Akk在優化培養基中發酵后，正離子模式下22種代謝產物顯著上調，28種代謝產物顯著下調，負離子模式下顯著上調代謝產物22種，顯著下調代謝產物28種。后續將對這些顯著性差異代謝產物進行分析。
2.4聚類分析
為了更全面直觀地顯示樣本之間的關系以及代謝物在不同樣本中的表達模式差異，將VIP值前50的顯著性差異代謝物用層次聚類進行聚類分析，結果如圖8所示。聚在同一簇內的代謝物具有相似的表達模式，可能具有相似的功能或者共同參與同一代謝過程或者細胞通路。
Akk發酵優化培養基產生的代謝產物中，顯著上調的代謝產物有肌酸、2-哌啶酮、2-氨基-1-苯乙醇、乙酰磷酸酯、煙曲霉素、巴多昔芬、N-乙酰-L-蛋氨酸、檸檬酸鹽、甘露糖和各種多肽等，這些代謝產物在人體疾病的調控中發揮著重要作用。文獻結果表明，Akk的這些代謝產物是該菌在緩解腸道炎癥，治療癌癥、神經系統等疾病主要功能因素。
顯著下調的產物有：烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿、煙酰胺、高三尖杉酯堿、靈芝酸、尿苷、焦谷氨酸、海藻糖、龍膽苦苷等。其中，烏頭堿是有毒植物中存在的一種毒性成分—二萜類生物堿，毒性極強，具有心臟毒性、神經毒性、生殖毒性、胚胎毒性，同時能通過血液吸收危害肝臟、腎臟等靶器官。實驗結果發現優化培養基中的烏頭堿顯著下調，說明Akk在優化培養基中發酵能更大程度發揮預防及治療心血管疾病、神經系統疾病、肝臟疾病的作用。除此之外的Akk代謝產物均被發現有一定抗炎、抗腫瘤、抗肥胖等益生功效，但是優化培養基中這些產物均有不同程度的下調，因此表明，補充Akk活菌制劑時應注意其有效菌數，過多的活菌數可能帶來疾病風險。也有研究提出，補充滅活Akk可顯著改善超重/肥胖的胰島素抵抗者的多項代謝指標，且安全性良好，效果優于Akk活菌，由此為其作為后生元提供了有效證據。
2.5 KEGG通路注釋與分析
在生物體內不同代謝物需要相互協調行使其生物學功能，基于KEGG通路分析有助于更進一步了解其生物學功能。為了解Akk在不同培養基中代謝產物含量變化的機制，將正負離子模式下檢測到的顯著性差異代謝物整合后進行KEGG通路注釋，并根據P值選擇顯著性最高的前20條KEGG通路進行富集，富集結果以氣泡圖的形式顯示，結果如圖9所示。
富集最顯著的5個通路為蛋白質的消化和吸收、氨酰基tRNA生物合成、膽汁分泌、ABC轉運蛋白、氨基酸生物合成。其中，蛋白質的消化和吸收通路富集最為顯著，強調蛋白質是Akk的第一營養需求，因此培養基優化主要針對這一需求進行。在這些通路中，蛋白質的消化和吸收、膽汁的分泌是Akk消化系統中的代謝通路，氨酰基tRNA生物合成在Akk的遺傳信息處理中發揮重要作用，ABC轉運蛋白涉及到Akk的膜運輸功能，對外界環境的信息進行處理，氨基酸生物合成則可合成多種氨基酸。
除膽汁分泌通路外，其余4種代謝通路均富集到了多種氨基酸，人體所需的多種必需氨基酸包含其中，這些氨基酸均由培養基中的氮源即卵清蛋白和酪蛋白胨代謝得到。富集到膽汁分泌通路上的代謝物有20種，這些代謝物包括茚地那韋、依托泊苷、普伐他汀、多西紫杉醇、阿昔洛韋、烏本苷、長春花堿等，其中茚地那韋是一種選擇性、強效和特異性的HIV蛋白酶抑制劑，目前用于治療獲得性免疫缺陷綜合征，還能顯著減輕鏈脲佐菌素誘導的阿爾茲海默癥（AD）相關的記憶缺陷，而相關研究表明，AD大鼠模型中，Akk可減輕AD大鼠的認知障礙。依托泊苷、多烯紫杉醇、長春花堿等均為有效的抗腫瘤和抗癌藥物，可應用于相應的癌癥治療。此外一些研究也證實了Akk在肺癌、結直腸癌、非小細胞肺癌等的治療中發揮了重要作用。因此表明，其膽汁分泌通路可能是Akk發揮其功效的重要通路之一。
蛋白質的消化和吸收通路中富集到了一種短鏈脂肪酸——丙酸，它除能維持腸道健康、緩解腸道炎癥外，在人體其他組織和器官中也可發揮重要作用，膳食中補充丙酸可通過抑制食欲提高胰島素敏感性，并增加能量消耗防止高脂飲食引起的肥胖。據報道，Akk在體外培養時主要代謝產物為丁酸和丙酸，而在優化培養基發酵后丙酸呈現顯著上調，一方面說明該培養基更有利于Akk發揮改善腸道疾病、減肥等作用。但目前也有報道，機體內有機酸累積與類風濕性關節炎有關。由此也表明，腸道中Akk活菌數量應保持一定上限，否則會帶來不良健康影響。
Akk發酵優化培養基通過影響其代謝通路，這些代謝通路產生代謝產物較硫乙醇酸鹽液體培養基顯著上調，一方面表明該培養基組分能使Akk更好地發揮抗腫瘤、調節機體免疫、緩解腸道炎癥等益生功能，另一方面，顯著下調的代謝產物則從側面說明如果腸道內Akk豐度過高可能帶來某些疾病風險，如增加骨關節炎及類風濕性關節炎等患病風險等，且如果人體本身患有腸道炎癥補充Akk活菌反而會加重病情。
結論
目前已知Akk與人體某些疾病存在重要關聯，但至今為止將其工業化高密度培養依然存在技術難題。本研究對硫乙醇酸鹽培養基進行了優化，篩選出了適合工業化生產的培養基配方，并通過非靶向代謝組學技術比較分析了Akk發酵優化培養基和硫乙醇酸鹽液體培養基產生的代謝產物之間的差異，這些代謝產物與Akk發揮抗炎、抗癌、調節腸-腦軸和腸-肝軸等功能密切相關；將這些差異性代謝物進行KEGG通路富集，發現Akk的蛋白質消化和吸收通路富集最為顯著，證明了影響該菌生長的最重要因素是蛋白質，同時也表明以此對培養基進行優化的合理性。為該培養基在工業化生產中應用提供了依據，也為將來Akk高密度培養以及作為后生元的可能性提供了研究和應用基礎。