?4株金黃色葡萄球菌噬菌體形態(tài)、生物學(xué)特性、生長(zhǎng)曲線及基因組特征（一）
金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus，SA）是一種常見的食源性致病菌，廣泛存在于水、空氣、人和動(dòng)物的皮膚等環(huán)境中。它可以引起傷口感染，誘發(fā)各種炎癥，甚至污染食品和食用農(nóng)產(chǎn)品，導(dǎo)致食物中毒事件的發(fā)生。使用抗生素（如氨芐西林、卡那霉素和萬古霉素等）來預(yù)防和控制SA是最直接有效的方法，但是過度使用抗生素會(huì)使金葡菌產(chǎn)生耐藥菌株，對(duì)人類和動(dòng)物健康造成危害，甚至對(duì)生態(tài)環(huán)境安全構(gòu)成威脅。因此，尋找可代替抗生素治療的生物制劑非常重要。
噬菌體是細(xì)菌的病毒，能夠?qū)Ｒ恍缘亓呀馑拗骷?xì)菌，作用機(jī)理明確。噬菌體對(duì)宿主細(xì)菌具有專一性能夠直接攻擊并殺害相應(yīng)致病菌，并且具有易于篩選、數(shù)量龐大、成本低廉的優(yōu)點(diǎn)。最重要的是用于人體和動(dòng)物較為安全，不會(huì)導(dǎo)致菌群出現(xiàn)耐藥性，甚至可以殺死耐藥菌，適合用于食品中多重耐藥SA的控制。目前，一些基于噬菌體的產(chǎn)品已經(jīng)在市場(chǎng)上上市，如ListexTMP100和ListShieldTM，它們的安全性得到美國食品和藥物管理局（FDA）的認(rèn)可，并被美國農(nóng)業(yè)部（USDA）批準(zhǔn)可以作為抗菌加工助劑，用于食品抗菌。噬菌體根據(jù)是否能進(jìn)行溶原途徑的生活史分為烈性噬菌體和溫和噬菌體，研究表明烈性噬菌體和溫和噬菌體均具有控制SA生長(zhǎng)的潛力。Ngassam-Tchamba等分離的三株烈性噬菌體（Romulus、Remus和ISP）在體外對(duì)與牛乳腺炎相關(guān)的SA具有良好裂解活性。分離的溫和噬菌體JS02對(duì)SA表現(xiàn)出較強(qiáng)的清除能力，并且能抑制SA生物膜的形成。將溫和噬菌體SA13隨機(jī)缺失突變后的突變噬菌體SA13m應(yīng)用于牛奶中抑制SA，結(jié)果顯示金葡菌在冰箱溫度（4℃）和室溫（25℃）下均降低至不可檢測(cè)的水平。Al-Anany等研究發(fā)現(xiàn)溫和噬菌體HK97與亞抑菌濃度的抗生素環(huán)丙沙星聯(lián)合使用，對(duì)SA具有良好清除效果。然而，尚未有研究系統(tǒng)性比較溫和噬菌體和烈性噬菌體在形態(tài)、生物學(xué)特性以及基因組組成上的差異。
本研究分離出4株SA的噬菌體（包括2株烈性噬菌體和2株溫和噬菌體），利用透射電鏡觀察其形態(tài)特征差異，隨后對(duì)所分離噬菌體的效價(jià)、宿主譜、耐酸堿能力、熱穩(wěn)定性、一步生長(zhǎng)曲線、最佳感染復(fù)數(shù)（Multiplicity of Infection，MOI）值等生物學(xué)特性進(jìn)行比較研究，最后通過全基因組測(cè)序比較分析烈性噬菌體和溫和噬菌體基因組特征。本文通過比較溫和噬菌體和烈性噬菌體在形態(tài)、生物學(xué)特性以及基因組組成的差異，為篩選更加高效的噬菌體作為生物抑菌劑，用于控制食品加工過程中金葡菌污染奠定理論基礎(chǔ)和數(shù)據(jù)支持。
1、材料與方法
1.1菌株及樣品來源
47株SA菌株YZUsa1-YZUsa47分離自江蘇省內(nèi)養(yǎng)豬場(chǎng)；ATCC 29213購自北京百歐博偉生物技術(shù)有限公司；3株SA菌株MRSA 85/2082、MRSA JCSC4744和MRSA WZ153來自揚(yáng)州大學(xué)生物危害因素防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；霍氏腸桿菌（Enterobacterhormaechei）Eh-YZU05分離自豬糞便，單核增生性李斯特菌（Listeriamonocytogenes）ATCC 1911、腸炎沙門氏菌（Salmonellaenteritidis）CICC 21513、大腸桿菌（Escherichiacoli）CICC 10664及最小弧菌（Vibrio mimicus）CICC 21613購自CICC菌種保藏中心。
1.2主要試劑和儀器
盧里亞-貝爾塔尼（Luria-Bertani，LB）培養(yǎng)基，購自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；Baird-Parker瓊脂基礎(chǔ)，購自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；腦心浸出液肉湯（Brain Heart Infusion，BHI），購自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；7.5%氯化鈉肉湯，購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；絲裂霉素C購自上海麥克林生物公司。
SW-CJ-1F型無菌操作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備制造有限公司；JEM-1200EX型透射電鏡，日本電子株式會(huì)社；HC-2066型高速離心機(jī)，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；H/T16MM型冷凍離心機(jī)，北京博勱儀器有限公司；BDY-2012型恒溫?fù)u床，上海百典儀器設(shè)備有限公司。
1.3噬菌體分離
1.3.1烈性噬菌體分離
利用SA菌株ATCC 29213作為宿主進(jìn)行SA噬菌體分離。采集揚(yáng)州市內(nèi)污水樣品500 mL，污水樣品的前處理過程以及噬菌體分離純化過程參照Chang等的方法進(jìn)行。用8 000 r/min的高速離心機(jī)離心10 min以除去雜質(zhì)，之后使用0.45μm和0.22μm濾器過濾除菌后，得到噬菌體原液。將3 mL 2×的LB培養(yǎng)基培養(yǎng)液和100μL培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SA菌株ATCC29213加入處理后的污水中，在37℃的溫度下?lián)u床培養(yǎng)8 h以上。將培養(yǎng)后的培養(yǎng)物經(jīng)過離心、過濾得到原液，并保存在4℃的冰箱。
1.3.2溫和噬菌體分離
挑取純化后的金葡菌YZUsa13和YZUsa14單菌落于LB液體培養(yǎng)基中，于37℃下?lián)u床培養(yǎng)12 h，調(diào)整菌液濃度為2×107CFU/mL。分別在LB培養(yǎng)基中加入167μL濃度為0.3 mmol/L的絲裂霉素C和菌液，置于37℃下?lián)u床培養(yǎng)6 h，每隔1 h取1 mL通過0.22μm濾膜后，與菌液各100μL加入10 mL離心管中，利用層平板法測(cè)定噬菌體滴度。
1.4透射電鏡觀察
噬菌體的形態(tài)學(xué)觀察：先將噬菌體液進(jìn)行濃縮，然后在200目碳涂層銅網(wǎng)上滴加20μL的濃縮后的噬菌體（1010PFU/mL）懸浮液，充分吸附約15 min后取出銅網(wǎng)使其自然干燥2～3 min。然后用2%（m/V）的磷鎢酸鈉（pH值為7.6）溶液染色2 min后，使用透射電鏡（TEM，Hitachi H600A）觀察噬菌體形態(tài)。
1.5噬菌體宿主譜的測(cè)定
噬菌體的宿主譜采用空斑法進(jìn)行測(cè)定，通過雙層平板法將100μL菌液（108CFU/mL）和5 mL的LB半固體培養(yǎng)基混勻后倒在LB固體培養(yǎng)基上，自然干燥后取10μL噬菌體培養(yǎng)液（MOI=100）滴在表面，倒放在37℃恒溫箱中培養(yǎng)。每組實(shí)驗(yàn)平行重復(fù)3次。
1.6生物學(xué)特性測(cè)定
1.6.1最佳感染復(fù)數(shù)的測(cè)定
最佳MOI的測(cè)定方法：將菌液濃度調(diào)整至1×106CFU/mL，按照噬菌體和宿主菌的不同比例（0.000 1、0.001、0.01、0.1、1、10和100）將噬菌體和宿主菌混勻后37℃搖床培養(yǎng)8 h后，于8 000 r/min條件下離心10 min，過濾并測(cè)定效價(jià)，效價(jià)最高的比例即為最佳MOI。每組做三次平行實(shí)驗(yàn)。
1.6.2一步生長(zhǎng)曲線（One-stepGrowth）的測(cè)定
一步生長(zhǎng)曲線的測(cè)定方法：將噬菌體和108CFU/mL宿主菌按照最佳MOI混合，37℃靜置培養(yǎng)7 min后8 000 r/min離心10 min，棄上清后加入5 mL的LB培養(yǎng)基重懸沉淀，放在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別于不同時(shí)間點(diǎn)（0、5、10、15、30、45、60、75和90 min）或（0、10、20、30、40、50、60、75、90、105、120、135、150、165、180、200、220和240 min）取100μL梯度稀釋后與宿主菌各100μL倒雙層平板。每組實(shí)驗(yàn)平行重復(fù)3次。
1.6.3耐酸堿性實(shí)驗(yàn)
噬菌體的耐酸堿性實(shí)驗(yàn)：分別取1 mL噬菌體于若干10 mL的離心管中，分別加入1 mL pH值為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0的SM緩沖液中，37℃下作用2 h后測(cè)定效價(jià)。
1.6.4熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)
噬菌體熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)：取1 mL效價(jià)約為108PFU/mL的噬菌體于試管中并放在40、50、60、70℃的恒溫金屬浴中依次作用20、40和60 min后測(cè)定效價(jià)。
1.7基因組測(cè)序及分析
對(duì)噬菌體SAPYZU-04、SAPYZU-15、SAPYZU-SapM13和SAPYZU-SapM14的全基因組序列進(jìn)行測(cè)定和分析。噬菌體基因組DNA提取參照文獻(xiàn)中所述方法。分別采用瓊脂糖凝膠電泳和Qubit®dsDNA HS分析試劑盒（Life Technologies，Carlsbad，CA，USA）對(duì)噬菌體基因組DNA進(jìn)行定性定量。
通過Illumina HiSeq平臺(tái)（Illumina，SanDiego，CA，USA）對(duì)噬菌體基因組序列進(jìn)行測(cè)定，插入片段大小為500 bp。使用FGENESB（http://www.softberry.com）、GeneMarkS和Glimmer v3.02軟件對(duì)開放閱讀框（Open Reading Frames，ORFs）進(jìn)行預(yù)測(cè)。通過InterProScan（http://www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/iprscan/）和BLASTp對(duì)ORFs進(jìn)行注釋。將基因組信息上傳至NCBI網(wǎng)站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/），SAPYZU-04、SAPYZU-15、SAPYZU-SapM13和SAPYZU-SapM14的GenBank編號(hào)分別為OP432864、MW864252、ON229621和ON220160。
1.8噬菌體系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建
截至2021年4月，GenBank數(shù)據(jù)庫中記錄192個(gè)金黃色葡萄球菌噬菌體基因組序列。本研究通過軟件kSNP3 v3.0對(duì)噬菌體SAPYZU-04、SAPYZU-15、SAPYZU-SapM13、SAPYZU-SapM14和上述192個(gè)SA噬菌體基因組序列的單核苷酸多態(tài)性（Single-Nucleotide Polymorphisms，SNPs）進(jìn)行解析并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。以噬菌體ErwiniaphagephiEa2809作為外組噬菌體，并使用iTOL進(jìn)行注釋。
1.9數(shù)據(jù)分析
實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD，n=3），每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中點(diǎn)線圖、柱狀圖由Origin 2023軟件繪制完成。
4株金黃色葡萄球菌噬菌體形態(tài)、生物學(xué)特性、生長(zhǎng)曲線及基因組特征（一）
4株金黃色葡萄球菌噬菌體形態(tài)、生物學(xué)特性、生長(zhǎng)曲線及基因組特征（二）
4株金黃色葡萄球菌噬菌體形態(tài)、生物學(xué)特性、生長(zhǎng)曲線及基因組特征（三）
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