?4株金黃色葡萄球菌噬菌體形態(tài)、生物學(xué)特性、生長曲線及基因組特征（三）
2.6一步生長曲線
將噬菌體SAPYZU-04、SAPYZU-15、SAPYZU-SapM13和SAPYZU-SapM14分別與宿主菌混合后培養(yǎng)，得到噬菌體的一步生長曲線。如圖6所示，烈性噬菌體SAPYZU-04和SAPYZU-15侵染宿主的10 min內(nèi)效價無明顯變化，表明它們的潛伏期均為10 min。在10～150 min內(nèi)，噬菌體SAPYZU-04和SAPYZU-15的效價一直保持升高趨勢，隨后趨于穩(wěn)定，表明它們的裂解期均約為140 min，裂解量分別約為每個細(xì)胞210和322 PFU。而溫和噬菌體SAPYZU-SapM13和SAPYZU-SapM14的潛伏期較長，分別約為15和30 min；裂解期較短，分別約為30和45 min，裂解量分別為每個細(xì)胞52和49 PFU。上述結(jié)果顯示，烈性噬菌體SAPYZU-04和SAPYZU-15的裂解量均高于Gutierrez等分離的金葡菌烈性噬菌體（每個細(xì)胞15和25 PFU）。溫和噬菌體SAPYZU-SapM13和SAPYZU-SapM14的裂解量比Feng等分離的溫和噬菌體JD419裂解量（每個細(xì)胞33 PFU）更高。潛伏期和爆發(fā)量是表示噬菌體裂解能力的重要生物學(xué)特性，具有較短潛伏期和較大爆發(fā)量的噬菌體更適合作為生物防治劑。
圖6噬菌體的一步生長曲線
2.7系統(tǒng)發(fā)育樹
全基因組序列分析結(jié)果顯示烈性噬菌體SAPYZU-04和SAPYZU-15基因組全長分別為140 584 bp和135 178 bp，而溫和噬菌體SAPYZU-SapM13和SAPYZU-SapM14的基因組全長分別為44 922 bp和44 232 bp。其中噬菌體SAPYZU-04的GC含量為31.48%，預(yù)測到188個ORFs；噬菌體SAPYZU-15的GC含量為29.90%，預(yù)測到187個ORFs；噬菌體SAPYZU-SapM13的GC含量為33.98%，包含71個ORFs；噬菌體SAPYZU-SapM14的GC含量為33.89%，包括73個ORFs。
截至2021年4月，GenBank數(shù)據(jù)庫中記錄192個金黃色葡萄球菌噬菌體基因組序列。本研究通過這些金黃色葡萄球菌噬菌體基因組序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，解析4株噬菌體和其他金黃色葡萄球菌噬菌體之間的關(guān)系。此樹形圖（圖7）劃分了3個主要的遺傳譜系（I-Ⅲ）。聚類分析結(jié)果表明，烈性噬菌體SAPYZU-04和SAPYZU-15與Hellelleviridae科的噬菌體聚在一個譜系中（譜系Ⅱ），且SAPYZU-04和SAPYZU-15與噬菌體qdsa001基因組核苷酸序列最相似，相似性＞99.0%；溫和噬菌體SAPYZU-SapM13和SAPYZU-SapM14與Azeredovirinae亞科Dubowvirus屬的噬菌體聚在一個譜系中（譜系Ⅲ），且SAPYZU-SapM13和SAPYZU-SapM14與TEM126和SAP26的基因組核苷酸序列一致性＞95%。因此，根據(jù)ICTV2022年最新的分類標(biāo)準(zhǔn)，噬菌體SAPYZU-04和SAPYZU-15屬于Hellelleviridae科；而SAPYZU-SapM13和SAPYZU-SapM14屬于Azeredovirinae亞科Dubowvirus屬。
圖7系統(tǒng)發(fā)育分析
2.8全基因組序列分析
對4株噬菌體基因組攜帶基因的蛋白功能進(jìn)行注釋，結(jié)果如圖8所示。噬菌體SAPYZU-04的基因組編碼32個DNA代謝相關(guān)基因，包括核酸內(nèi)切酶基因（orf38）、DNA解旋酶基因（orf115）和DNA聚合酶Ⅰ基因（orf144）等；噬菌體SAPYZU-15的基因組包含多個DNA代謝基因，其中包括3個DNA合成相關(guān)基因（orf1、orf3和orf5）、2個DNA聚合酶Ⅰ（orf10、orf11）和DNA綁定蛋白（orf82）；噬菌體SAPYZU-SapM13的基因組編碼13個與噬菌體DNA復(fù)制、調(diào)節(jié)和轉(zhuǎn)錄相關(guān)的基因，包括核酸外切酶基因（orf7）、轉(zhuǎn)錄因子（orf9）、DNA復(fù)制基因（orf25）和DNA解旋酶（orf45）等；而噬菌體SAPYZU-SapM14編碼11個與噬菌體DNA代謝相關(guān)的基因，包括轉(zhuǎn)錄因子（orf11）、DNA綁定蛋白（orf24）、DNA解旋酶（orf28）和核酸內(nèi)切酶（orf51）等。其中SAPYZU-15基因組編碼豐富的DNA合成基因加速了噬菌體大分子的合成。SAPYZU-04的基因組編碼3個DNA組裝基因（orf66、orf68和orf69），SAPYZU-15的基因組編碼1個DNA組裝基因（orf117），SAPYZU-SapM13和SAPYZU-SapM14均包含2個DNA包裝基因（分別為orf48、orf49、orf52和orf53）。其中SAPYZU-15編碼的DNA包裝基因與噬菌體LSA2308的氨基酸序列具有95.9%的相似性；LSA2308的爆發(fā)量約為407 PFU/cell。DNA包裝蛋白可以有效地將DNA泵入尾部噬菌體原衣殼中，加速噬菌體的組裝。噬菌體SAPYZU-04和SAPYZU-15的基因組中分別包含3個和1個尾部蛋白基因（分別為orf108、orf110、orf158和orf142），噬菌體SAPYZU-SapM13編碼5個尾部相關(guān)蛋白基因，包括尾管蛋白基因（orf57）和主要尾部蛋白基因（orf58和orf62）等；而SAPYZU-SapM14編碼6個尾部相關(guān)蛋白基因，包括尾部蛋白基因（orf57、orf61、orf62）等。這些獨特的尾部蛋白基因可能是此4株噬菌體具有廣泛的裂解譜的原因。其中SapYZU-15含有的尾蛋白基因與噬菌體KSAP11的基因組氨基酸序列有95.90%的相似性。KSAP11具有廣泛的裂解譜，對30株SA菌株（包括MSSA和MRSA菌株）具有裂解活性。噬菌體SAPYZU-04包含1個穿孔素基因（orf53）和3個裂解酶基因（orf52、orf100和orf102），SAPYZU-15包含1個穿孔素基因（orf107）、5個裂解酶基因（orf103、orf105、orf149、orf153和orf155）；而SAPYZU-SapM13和SAPYZU-SapM14的基因組均只包含1個穿孔素基因（分別為orf70和orf2）和1個裂解酶基因（分別為orf71和orf3）。穿孔素基因在裂解過程中誘導(dǎo)宿主細(xì)胞膜去極化，調(diào)節(jié)裂解時間。其中SAPYZU-15基因組中有2個裂解酶基因（orf103和orf155）與MR003具有較高的氨基酸序列相似性（97.90%和99.00%），MR003是高效的SA烈性噬菌體。因此，在這些基因的協(xié)同作用下，噬菌體SAPYZU-04和SAPYZU-15潛伏期更短，裂解量更高。此外，溫和噬菌體基因組中的整合酶基因和CI阻遏蛋白是決定其生命周期的重要因素，整合酶基因通過催化兩個DNA分子之間重組使得噬菌體在宿主染色體中進(jìn)行基因的整合和切除，并且溫和噬菌體通過CI阻遏蛋白阻斷裂解基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，從而進(jìn)入溶原周期；而抗阻遏蛋白控制噬菌體在侵染時進(jìn)入裂解周期。本文的溫和噬菌體SAPYZU-SapM13和SAPYZU-SapM14基因組編碼特異性整合酶證明它們具有溶原性，均預(yù)測到抗阻遏蛋白，但是未預(yù)測到CI阻遏蛋白和噬菌體抗性基因，可能導(dǎo)致溫和噬菌體SAPYZU-SapM13和SAPYZU-SapM14在宿主譜測定時易進(jìn)入裂解周期，上述結(jié)果與Tian等的研究結(jié)果一致。
圖8全基因組分析
3、結(jié)論
金黃色葡萄球菌嚴(yán)重威脅食品安全，同時也是全球關(guān)注的重大公共衛(wèi)生問題之一。因此，迫切需要開發(fā)安全可靠的生物防治方法，以提高公共衛(wèi)生水平，確保消費者安全。本研究分離的烈性噬菌體SAPYZU-04和SAPYZU-15效價均達(dá)到109PFU/mL，而且具有較寬的裂解譜，兩株噬菌體對51株SA菌株的裂解率均高達(dá)100%；在40～60℃溫度范圍內(nèi)、pH值在3～12范圍內(nèi)均保持良好活性；潛伏期較短、裂解能力強，裂解量分別高達(dá)每個細(xì)胞210和322 PFU。全基因組序列分析結(jié)果顯示SAPYZU-04和SAPYZU-15均包含多種DNA代謝基因、多個裂解酶基因、獨特的DNA包裝基因及尾部蛋白基因。因此，烈性噬菌體SAPYZU-04和SAPYZU-15是一種更合適、更有前景的生物防治選擇，有望應(yīng)用于控制食品中金葡菌的污染。
4株金黃色葡萄球菌噬菌體形態(tài)、生物學(xué)特性、生長曲線及基因組特征（一）
4株金黃色葡萄球菌噬菌體形態(tài)、生物學(xué)特性、生長曲線及基因組特征（二）
4株金黃色葡萄球菌噬菌體形態(tài)、生物學(xué)特性、生長曲線及基因組特征（三）
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