基于水凝膠的快速液體噬菌體敏感性測定，通過液體生長測定來測量細菌生長
研究背景：噬菌體療法是治療抗生素耐藥細菌引起的感染的一種替代方法。由于噬菌體的宿主范圍狹窄，需要數百至數千個噬菌體才能覆蓋細菌病原體的多樣性。在個性化噬菌體治療中，針對個體患者快速選擇噬菌體對于成功治療至關重要。本研究的目的是建立一種基于水凝膠的快速液體噬菌體敏感性測定（PST），用于選擇用于治療用途的噬菌體，并建立“即用型篩選”平板概念，其中噬菌體很容易儲存在水凝膠中作為微量滴定板孔中的小液滴。
研究人員首先測試了四種市售水凝膠（GrowDex、Askina、Purilon和Intrasite）在具有四種噬菌體的PST中作為噬菌體基質的適用性，其中兩種噬菌體感染大腸桿菌，兩種噬菌體感染金黃色葡萄球菌。在這四種水凝膠中，GrowDex是PST的最佳基質，因為它不會抑制細菌生長，與細菌培養物混合時會快速釋放噬菌體，并能很好地保持噬菌體活力。使用GrowDex作為矩陣，以代表10個不同物種的23種細菌菌株和具有不同形態和基因組大小的23種噬菌體，優化了光密度法（OD）和Biosense微生物動態監測系統（圖像分析法）的測定。當用Biosense微生物動態監測系統監測細菌生長時，PST只需3小時即可完成，并且在測定前不需要過夜培養細菌細胞，而使用光密度法（OD）則必須將細菌預培養過夜，并且測定時間為五個小時。最后通過六種模型噬菌體進行為期六個月的穩定性測定，評估了三種不同化學穩定劑（海藻糖、透明質酸和明膠）的效果。這些噬菌體測定在化學穩定劑方面表現非常不同，并且沒有一種穩定劑適合所有噬菌體。然而當使用明膠（0.01%）或透明質酸（0.2 mg/ml）作為穩定劑時，所有測試的噬菌體在1 ml體積儲存六個月后在PST中仍然被認為是陽性。
oCelloScope微生物動態監測系統用于通過液體生長測定來測量細菌生長。為了測試細菌起始濃度和生長期對測定的影響，細菌在5 ml LB中預培養過夜，在1.3 ml LB中預培養兩小時，直接從平板上挑取細菌接種到1 ml LB中被使用。用DSM細胞密度計測量細菌培養物吸光度(OD 600)調節至0.35并用LB稀釋1:20至1:1000。將10μl液滴中的噬菌體裂解物(105-109 PFU/ml)添加到96孔微量滴定板的底部，然后添加200μl稀釋的細菌培養物。作為對照，將200μl細菌培養物與10μl LB一起添加到孔中。將板用qPCR粘性透明板密封件覆蓋，并在oCelloScope中于37°C下培養（無需搖動）。每30分鐘至10小時采集一次圖像。每個樣品一式三份進行分析，并計算平均值和標準差。oCelloScope微生物動態監測系統測試方法的增強靈敏度使其能夠記錄比傳統OD法小得多的細菌濃度變化。該方法可以在不使用過夜細菌培養物的情況下跟蹤對數生長曲線（從而檢測噬菌體感染）。為此使用過夜培養物稀釋的細菌、三小時預培養物以及直接從平板培養物中挑選的細菌來接種生長曲線。
實驗結論
開發了一種快速、耐儲存的PST（快速液體噬菌體敏感性測定），它利用納米原纖纖維素水凝膠和明膠作為噬菌體存儲基質。使用Biosense微生物動態監測系統的基于圖像分析法測量細菌生長時的檢測時間短至三個小時，并且無需在檢測前準備臨床細菌的過夜預培養物。當以1 ml體積儲存時，所有測試的噬菌體在水凝膠混合物中保持活力至少六個月，并以10μl液滴形式在“準備篩選”板中保持兩個月。在準備篩選的平板中使用水凝膠作為噬菌體存儲基質將能夠快速高通量篩選噬菌體以進行個性化噬菌體治療。
圖1、使用光密度法（A、B）和oCelloScope微生物動態監測系統（C、D）優化細菌生長曲線。(A)光密度法中大腸桿菌菌株#5506的生長曲線。將過夜細菌培養物在溶源肉湯(LB)中稀釋至1:50、1:100和1:500稀釋度。將200μl體積的細菌稀釋液添加到微量滴定孔板中，并使用吸光度讀數器以600 nm處的光密度(OD)每隔1小時測量細菌生長，持續5小時。(B)吸光度讀數器中銅綠假單胞菌菌株#6329的生長曲線。將過夜細菌培養物在溶源肉湯(LB)中稀釋至1.10、1:20、1:40、1:100和1:200稀釋度。將細菌稀釋液以200μl體積添加到微量滴定孔板中，并按照A中的方法測量細菌生長。(C)使用oCelloScope微生物動態監測系統觀察銅綠假單胞菌菌株#6329的生長曲線。過夜細菌培養物在LB中稀釋至1:40、1:80、1:120和1:160。將200μl體積的稀釋培養物添加到微量滴定孔板中。每隔30分鐘跟蹤一次細菌生長情況，持續8小時。(D)使用oCelloScope微生物動態監測系統觀察大腸桿菌菌株#5521的生長曲線。細可預培養三個小時，也可以直接從平板上挑取并懸浮在LB中。將3小時預培養的OD調整至0.35并進一步稀釋1:200，并將200μl稀釋液等分到微量滴定板孔中。每隔30分鐘跟蹤一次細菌生長情況，持續5小時。
圖2、液相噬菌體藥敏試驗與噬菌體PA8P1平板接種效率的相關性。將10μl PA8P1液滴(10 9 PFU/ml)轉移到微量滴定板孔的底部。將銅綠假單胞菌菌株#6709、#6329、#6705和#6710的過夜培養物按1:40稀釋，并將200μl細菌稀釋液添加到孔中。將板在37°C和200 rpm下孵育，并以一小時的間隔測量600 nm處的吸光度。
圖3、四種商業水凝膠對細菌生長的影響。將水凝膠Askina、Intrasite、Purilon和GrowDex以10μl液滴的形式添加到微量滴定孔板的底部。過夜培養的大腸桿菌菌株#5521和金黃色葡萄球菌菌株#6433分別按1:500和1:100稀釋。將200μl這些細菌稀釋液添加到孔中，并將板在37°C和200 rpm下孵育5小時。以一小時的間隔測量600 nm處的吸光度。在不含水凝膠的溶源肉湯中生長的細菌作為對照。每個樣品一式三份進行分析，并顯示平均值和標準差。
圖4、使用在噬菌體-水凝膠組合物中儲存六個月的噬菌體進行噬菌體敏感性測試。將噬菌體fHoEco02、fTuEco01、fPoEco01、fRuSau02、mEBHT和KpGranit與水凝膠以及3.3%、2.0%或1.0%海藻糖(TH)、0.2 mg/ml或1.0 mg/ml透明質酸(HA)、0.01一起保存%明膠，或不含穩定劑(SM)，裝在2 ml試管中，保存六個月。將10μl噬菌體混合物添加到微量滴定板孔的底部，并將200μl稀釋的過夜細菌培養物添加到孔中。通過在600 nm處以30分鐘的間隔測量光密度，持續5小時來跟蹤細菌生長。所有測量均一式三份進行，并標明平均值和SD值。沒有噬菌體的溶源肉湯中的細菌生長作為對照。
圖5、使用在噬菌體-水凝膠組合物中儲存六個月的噬菌體進行噬菌體敏感性測試。將噬菌體fHoEco02、fTuEco01、fPoEco01、fRuSau02、mEBHT和KpGranit與水凝膠以及3.3%、2.0%或1.0%海藻糖(TH)、0.2 mg/ml或1.0 mg/ml透明質酸(HA)、0.01一起保存%明膠，或不含穩定劑(SM)，裝在2 ml試管中，保存六個月。將10μl噬菌體混合物添加到微量滴定板孔的底部，并將200μl稀釋的過夜細菌培養物添加到孔中。通過在600 nm處以30分鐘的間隔測量光密度，持續5小時來跟蹤細菌生長。所有測量均一式三份進行，并標明平均值和SD值。沒有噬菌體的溶源肉湯中的細菌生長作為對照。
總結
自噬菌體發現以來，傳統的PST方法尚未發生重大變化。傳統方法（即雙層瓊脂測定）通常需要24至48小時，并且可能需要更長的時間，具體取決于噬菌體集合的大小和要篩選的臨床細菌分離株的數量。一些用于斑塊分析和定量的自動化工具已經發布。本論文研究人員創建了一種快速且強大的PST，可普遍用于許多臨床相關的細菌物種。開發了一種基于水凝膠的液體PST，并用代表10個不同物種的23個細菌菌株和具有不同形態的23個噬菌體對其進行了優化。該測定法進一步用另外20種銅綠假單胞菌菌株和四種銅綠假單胞菌特異性噬菌體進行了驗證。通過使用兩種不同的方法，光密度法（OD）和圖像分析法（Biosense微生物動態監測系統）來測量噬菌體感染時的細菌生長。本研究中研究人員開發了的這種利用水凝膠作為噬菌體基質的液體培養PST方法。該方法適用于傳統OD讀數器以及圖像分析法（oCelloScope微生物動態監測系統）。但是使用OD讀數儀進行檢測時，需要對宿主細菌進行過夜培養，然后測試本身可以在五個小時內運行。而如果使用圖像分析法（oCelloScope微生物動態監測系統），大多數測試的細菌物種不需要任何預培養步驟，并且只需三個小時即可完成測定。這種基于水凝膠的測定為大型和小型商業、研究和臨床實驗室提供了一種快速且自動化友好的方法，增強了對適合個性化雞尾酒制備的噬菌體的選擇，并減少了從實驗室到臨床的時間。
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