產脂肪酶地衣芽孢桿菌LD-1302篩選、培養基及產酶條件研究（三）
2結果
2.1產脂肪酶菌株的篩選
從羅丹明B初篩固體培養基上篩選得到10株水解圈較大的菌株，這些菌株在350 nm紫外燈下觀察，在菌落周圍均有明顯的橙黃色熒光圈（圖1）。重復3次搖瓶發酵后，10株菌的產脂肪酶活性存在一定的差異（表1），其中菌株LD-1302的產脂肪酶活性最高，酶活達（22.58±0.09）U/mL。發酵24 h后，LD-1302培養基表面存在不溶于水且浮在水面的絮凝狀乳白色蠟樣物質，48 h后該絮凝狀乳白色蠟樣物質消失。
圖1 350 nm紫外燈下產脂肪酶菌落周圍的橙黃色熒光圈
表1 10株產脂肪酶菌株的酶活
2.2菌株鑒定結果
2.2.1菌落形態及鏡檢
LD-1302菌落形狀不規則、凸面、白色不透明、邊緣為毛發狀；革蘭氏染色鏡檢呈紫色，為G+菌；芽孢染色鏡檢可觀察到綠色的芽孢、顯紅色的營養體。
2.2.216S rDNA序列測定與分析
以菌株LD-1302的DNA為模版，經細菌16SrDNA通用引物擴增獲得序列長度為1 512 bp的基因片段，對其測序并提交Genbank核酸序列數據庫。同源性分析結果表明，菌株LD-1302的16S rDNA基因序列與Genbank中的BCRC 15413等15株芽孢桿菌屬細菌的同源性達99.9%以上，利用MEGA 6.1構建系統進化樹，結果表明該菌株與地衣芽孢桿菌B.licheniformis聚為一支（圖2）。初步鑒定菌株LD-1302為地衣芽孢桿菌。
2.2.3生理生化鑒定
菌株LD-1302可于55℃下生長、淀粉水解試驗菌落四周出現無色透明圈、明膠水解培養基出現液化現象、V-P試驗培養基顯紅色、V-P試驗培養基的終pH顯酸性、檸檬酸鹽及丙酸鹽培養基顯藍色、均可在NaCl 5%、NaCl 7%的肉湯培養基中生長、在pH5.7、pH6.8的肉湯培養基中生長良好，符合對地衣芽孢桿菌的描述（東秀珠等，2001）。結合革蘭氏染色、芽孢染色及16S rDNA序列測定與分析結果，鑒定菌株LD-1302為地衣芽孢桿菌。
圖2菌株LD-1302的16S rDNA序列系統發育樹
2.3活菌總數計數
地衣芽孢桿菌LD-1302在以橄欖油為唯一碳源的生長培養基中延滯期較短，培養6 h活菌總數達到最高，為（94.67±3.21）×106CFU/mL，LD-1302在6～20 h內生長較為穩定，表明該菌株可利用有機碳源橄欖油，并在6 h時將培養基營養物質基本消耗殆盡（圖3）。
圖3菌株LD-1302的生長曲線
2.4接種量對LD-1302產酶活性的優化
由圖4可知：以橄欖油為碳源時，菌株LD-1302的最適接種量為1.50%，即菌株起始接種濃度為3.75×105CFU/mL時，產脂肪酶活性最高，酶活可達到（31.64±0.34）U/mL，且在最少接種濃度為1.25×105CFU/mL時，也存在較高的產脂肪酶活性。采用SPSS 18.0統計軟件分析數據可知：接種量P=0.00<0.01、時間P=0.001<0.01，表明接種量、時間均對酶活影響極顯著；由接種量-酶活的同類子集結果可知：接種量為0.50%、2.50%時，酶活均值分別為15.35 U/mL、17.87 U/mL，在同一子集中，表明兩者對產脂肪酶活無明顯差異；接種量為1.00%、2.00%時，酶活均值分別為20.68 U/mL、19.02 U/mL，在同一子集中，表明兩者對產脂肪酶活無明顯差異，但產酶效果優于前兩者；接種量為1.50%時，酶活均值為26.53 U/mL，與前四者分屬不同子集，表明為接種量為1.50%時，產脂肪酶效果最好；由時間-酶活的同類子集結果可知：72 h時，酶活均值為17.72 U/mL，24 h、48 h時，酶活均值分別為21.35 U/mL、20.60 U/mL，在同一子集中，表明兩者對產脂肪酶活無明顯差異，但產脂肪酶活優于前者。
2.5碳源對LD-1302產酶活性的影響
圖4接種量對LD-1302利用橄欖油產脂肪酶的影
由圖5可知：最適接種量的LD-1302經橄欖油、椰子油、葵花籽油誘導，最高產脂肪酶活分別為（23.42±0.84）U/mL、（10.76±0.51）U/mL、（9.77±0.51）U/mL。采用SPSS 18.0統計軟件分析數據可知：碳源、時間的P=0.00<0.01，表明碳源、時間均對酶活影響極顯著；由碳源-酶活的同類子集結果可知：以椰子油、葵花籽油為碳源時，酶活均值均為8.51 U/mL，在同一子集中，表明兩者對產脂肪酶活無明顯差異，而以橄欖油為碳源時，酶活均值為17.54 U/mL，與椰子油、葵花籽油分屬不同子集，表明以橄欖油為碳源時，產脂肪酶效果最好；由時間-酶活的同類子集結果可知：24 h、72 h時，酶活均值分別為10.84 U/mL、9.06 U/mL，在同一子集中，表明兩者對產脂肪酶活無明顯差異，48 h時，酶活均值為14.66 U/mL，與前兩者分屬不同子集，表明48 h時，產脂肪酶活效果最好；同時椰子油、葵花籽油也可誘導該菌株產生較高的酶活。
圖5碳源對產酶的影響
產脂肪酶地衣芽孢桿菌LD-1302篩選、培養基及產酶條件研究（一）
產脂肪酶地衣芽孢桿菌LD-1302篩選、培養基及產酶條件研究（二）
產脂肪酶地衣芽孢桿菌LD-1302篩選、培養基及產酶條件研究（三）
產脂肪酶地衣芽孢桿菌LD-1302篩選、培養基及產酶條件研究（四）
產脂肪酶地衣芽孢桿菌LD-1302篩選、培養基及產酶條件研究（五）