巨大芽孢桿菌BM24生長曲線、耐藥性、益生潛力評估及藥敏試驗（二）
1.2試驗方法
1.2.1芽孢桿菌分離
取新鮮糞便放入無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)中，渦旋混勻，水浴鍋80℃加熱處理20 min，靜置后取100μL上清液接種于LB肉湯中，37℃下恒溫培育18 h，梯度稀釋，取10-4、10-5和10-6稀釋度的菌液于LB瓊脂平板上涂布，倒置培養。挑出不同形態的單菌落，接種純化3代，直至平板上的菌落形狀、大小、顏色一致，采用革蘭氏染色與芽孢染色法觀察形態，鏡檢篩選出形態呈桿狀且有內生孢子的菌株，將其菌液與60%滅菌甘油等體積混合，于-80℃凍存備用。
1.2.2分離菌株生化鑒定
使用HBI芽孢桿菌生化鑒定條對分離菌株進行生化反應鑒定，鑒定結果與《伯杰氏系統細菌手冊》比對。
1.2.3分離菌株16S rRNA基因序列分析
參考水煮法提取細菌DNA作為PCR擴增模板，細菌通用引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')用于PCR擴增鑒定，引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。擴增體系:Premix Taq 10μL，上、下游引物各0.5μL，基因組DNA 5μL，ddH2O 4μL。PCR反應條件:95℃預變性3 min;95℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸30 s，共30個循環;72℃延伸5 min;擴增產物4℃保存。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物，將PCR擴增產物送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序分析，測序結果上傳于NCBI網站進行序列比對，分析其種屬。
1.2.4分離菌株的益生潛力評估
1.2.4.1耐酸性
調整LB肉湯的pH分別為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0，滅菌后備用。將凍存的分離菌株接種至LB肉湯，37℃、180 r/min搖床過夜培養，按1%的接種量接入不同pH的LB肉湯中，37℃搖床培養4 h后吸取200μL菌懸液至酶標板中，于酶標儀檢測其在600 nm處的吸光度(OD600)值，以LB肉湯(pH 7.0)為對照，測量樣品分為3份，每份重復測定3次，計算菌株相對存活率。
相對存活率(%)=(試驗組OD600值/對照組OD600值)×100。
1.2.4.2耐膽鹽
配制分別含有0.1%、0.2%、0.3%膽鹽的LB肉湯備用。將凍存的分離菌株接種至LB肉湯，37℃、180 r/min搖床過夜培養，按1%的接種量接入不同膽鹽濃度的LB肉湯中，37℃搖床培養4 h后吸取200μL菌懸液至酶標板中，于酶標儀檢測其OD600值，以不添加膽鹽的LB肉湯為對照，測量樣品分為3份，每份重復測定3次，按照1.2.4.1中公式計算菌株相對存活率。
1.2.4.3藥敏試驗
采用紙片擴散法(K-B法)測定分離菌株對青霉素G、萬古霉素、鏈霉素等15種抗菌藥物的抗生素敏感性。取100μL過夜培養的菌懸液均勻涂布于LB瓊脂培養基上，再將所選藥敏片貼在培養基表面，并輕輕壓實，于37℃恒溫培養箱中過夜培養，通過測量藥敏片周圍抑菌圈直徑大小來判斷菌株的藥物敏感性。結果判定參照《紙片法抗菌藥物敏感試驗標準》(WS/T 125-1999)。
1.2.4.4溶血活性
使用無菌脫纖維綿羊血制備綿羊血平板備用。分離菌株活化后在綿羊血平板上劃線，于37℃恒溫培養箱中過夜培養，觀察菌落周圍是否出現溶血環。
1.2.4.5抗菌活性
采用牛津杯法測定分離菌株的抗菌活性。將病原菌(大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌)均勻涂布于LB瓊脂培養基，將牛津杯放置于LB瓊脂平板上，輕輕按壓，在牛津杯中加入200μL(108 CFU/mL)分離菌株的菌懸液，37℃恒溫培養箱過夜培養，測定抑菌圈直徑。
1.2.5生長曲線
取過夜培養的菌懸液，按1%的接種量接入LB肉湯中，37℃、180 r/min振蕩培養24 h，每隔2 h取菌懸液1次，共取12次，以無菌LB肉湯為對照，利用微生物生長曲線分析儀測定OD600值，重復測定3次，繪制生長曲線。
1.2.6體內安全性
參照農業農村部制定的《直接飼喂微生物和發酵制品生產菌株鑒定及其安全性評價指南》對分離菌株進行安全性評估。
1.2.6.1灌胃
10只小鼠適應環境7 d后隨機分為2組，對照組灌胃生理鹽水(0.2 mL/只)，試驗組灌胃活菌數為108 CFU/mL的分離菌株(0.2 mL/只)，持續灌胃14 d。小鼠自由采食和飲水。每日灌胃前記錄小鼠的體重變化，同時觀察小鼠毛色、整體精神狀態及分泌物、排泄物狀況。灌胃結束后，采集小鼠血液，進行血細胞指標分析;將小鼠安樂死后取肝臟、脾臟、腎臟，無塵紙擦干表面水分后稱重，計算臟器指數。
臟器指數(%)=[臟器重(g)/體重(g)]×100。
1.2.6.2腹腔注射
10只小鼠適應環境7 d后隨機分為2組，對照組腹腔注射生理鹽水(0.2 mL/只)，試驗組腹腔注射活菌數為108 CFU/mL的分離菌株(0.2 mL/只)，小鼠自由采食和飲水，僅在第1天注射，觀察小鼠毛色、整體精神狀態及分泌物、排泄物狀況，連續觀察7 d。7 d后將小鼠安樂死，解剖觀察各組織器官是否存在病理變化。
1.3數據處理與分析
試驗數據用SPSS 26.0進行t檢驗，GraphPad Prism 8作圖，數據結果表示為平均值±標準差。P<0.05表示差異顯著，P>0.05表示差異不顯著。
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