基于微生物生長曲線監測系統探究肺炎克雷伯菌菌株毒力與碳青霉烯類耐藥性的關系（三）
2.4 CR-HVKP菌株的基因組特征和藥敏試驗結果
CR-HVKP菌株分離自重癥監護病房的一例41歲急性白血病女性患者，同時患有肺炎和肝包蟲病，并發感染性休克。PCR未檢測到該株CR-HVKP菌株攜帶碳青霉烯類基因，全基因組測序結果顯示其攜帶blaSHV-145、blaTEM-1、blaCTX-M-3、fosA6、oqxA5、oqxB26和aac（3）-IId耐藥基因，MLST型別為412，OmpK35和OmpK36基因中存在IS10L插入序列，攜帶rmpA、iutA、entB、mrkD和fimH毒力基因，莢膜抗原分型為K57，具有高黏表型。藥敏試驗結果顯示，該株CR-HVKP對頭孢類、酶抑制劑、厄他培南和美羅培南耐藥，對亞胺培南中介，對氟喹諾酮類敏感。由于患者存在免疫缺陷及多重感染，故采用頭孢哌酮舒巴坦、利奈唑胺、莫西沙星、亞胺培南單用或聯用進行抗感染治療，同時接受長春瑞濱和順鉑化療。患者最終因本次感染預后不佳要求出院。
2.5 CR-HVKP菌株的毒力鑒定結果
生物膜形成試驗發現，不攜帶碳青霉烯酶基因CRKP、CSKP、攜帶碳青霉烯酶基因CRKP、CS-HVKP、CR-HVKP、標準菌株ATCC700603的吸光度值依次為0.480、0.297、0.628、0.500、0.767、0.292，其中CR-HVKP生物膜形成能力最強，其后依次為攜帶碳青霉烯酶基因CRKP（強）、CS-HVKP（中等）、不攜帶碳青霉烯酶基因CRKP（中等）、CSKP（弱）和標準菌株ATCC700603（弱）。血清抗性試驗結果顯示，CR-HVKP和CS-HVKP為高抵抗（6級），攜帶碳青霉烯酶基因CRKP為中等抵抗（4級），其余菌株對血清無抵抗（2級），見圖1。結果表明，CR-HVKP菌株的毒力較CRKP、CSKP和CS-HVKP菌株均有明顯提高。
圖1六株肺炎克雷伯菌血清抗性試驗結果
CR-HVKP攜帶5個毒力基因（entB、rmpA、mrkD、iutA和fimH），呈現高黏表型，未檢測到碳青霉烯酶基因；不攜帶碳青霉烯酶基因CRKP攜帶3個毒力基因（entB、mrkD和fimH）；攜帶碳青霉烯酶基因CRKP攜帶blaKPC-2基因和3個毒力基因（entB、mrkD和fimH）；CS-HVKP攜帶7個毒力基因（entB、mrkD、fimH、iutA、rmpA、ybtS和aerobictin），呈現高黏表型；CSKP攜帶3個毒力基因（entB、mrkD和fimH）.CR-HVKP：碳青霉烯類耐藥高毒力肺炎克雷伯菌；CRKP：碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌；CS-HVKP：碳青霉烯類敏感高毒力肺炎克雷伯菌；CSKP：碳青霉烯類敏感肺炎克雷伯菌；entB：鐵載體腸桿菌素；rmpA：黏液樣表型A調節基因；mrkD：黏附因子3型菌毛基因；iutA：鐵載體氣桿菌素；fimH：黏附因子1型菌毛基因；ybtS：鐵載體耶爾森桿菌素；aerobictin：鐵載體需氧菌素.
3討論
肺炎克雷伯菌引起的血液感染病死率高、患者住院時間延長和醫療費用增加。全球肺炎克雷伯菌的耐藥性和毒力水平升高，需要尋找新的治療方案。本研究對四川大學華西醫院192例血液感染的肺炎克雷伯菌進行分析，探討肺炎克雷伯菌毒力因子與碳青霉烯類耐藥性之間的關系。
本文資料顯示，96株CRKP中攜帶blaKPC-2占83.7%，攜帶blaNDM-5占12.0%，同時攜帶blaKPC和blaNDM占4.3%，與Wang等的研究結果基本一致。
肺炎克雷伯菌的耐藥性已成為公認的治療難題，而高毒力菌株的存在則會使得治療更加困難。截至目前，與肺炎克雷伯菌毒力相關的因素主要有莢膜、鐵載體、脂多糖、毒力質粒pLVPK和KPHP1208致病島等。本研究對肺炎克雷伯菌毒力相關的菌毛（mrkD、fimH）、鐵載體（entB、aerobictin、iutA、ybtS、Kfu）、尿囊素代謝（allS）和莢膜（K1、K2、K5、K20、K54、K57、rmpA、magA）進行研究。其中，菌毛與細菌黏附有關；鐵載體相關蛋白如Kfu蛋白可通過螯合作用促進游離鐵吸收，并促進Kfu基因編碼產物的產生，提高細菌的生長和定植能力；在需氧或厭氧條件下，allS基因負責尿囊素的厭氧同化，作為碳、氮和能量的唯一來源，小鼠致死試驗顯示allS基因與菌株的毒力顯著相關；莢膜可以保護細菌不被吞噬，通過阻止抗菌肽和補體在細菌表面的沉積，避免抗菌肽和補體的殺菌作用。本文資料顯示，CRKP和CSKP攜帶mrkD和fimH的比例均超過90%，表明肺炎克雷伯菌普遍產生Ⅰ型和Ⅲ型菌毛。但是，與CRKP比較，CSKP中aerobictin、iutA、ybtS和Kfu的陽性率明顯升高，提示CSKP比CRKP具有更強的存活、定植和鐵攝取能力；CSKP中allS基因和莢膜相關基因的陽性率也均高于CRKP，且與高毒力相關的莢膜血清型K1和K2在CSKP中更為常見，檢出率分別為20.8%和13.5%。
此外，既往研究顯示，與侵襲性感染密切相關的allS和Kfu僅存在于莢膜血清型K1的肺炎克雷伯菌中；而本研究在K57 CRKP和K1 CSKP分離株中均檢出allS和Kfu基因，推測莢膜血清型K57菌株亦可能與侵襲性感染高度相關。此外，17.7%CSKP攜帶10種毒力基因，13.5%CSKP攜帶7種毒力基因，但大多數CRKP（87.5%）只攜帶3種毒力基因。上述結果提示，CRKP雖能抵抗抗菌藥物，但其捕獲鐵離子和逃避宿主免疫攻擊的能力不如CSKP；CRKP攜帶的毒力基因數和種類少于CSKP，莢膜抗原（K1和K2）主要存在于CSKP細菌中，其原因可能是基于能量平衡規律，在獲得耐藥基因的同時，毒力基因相對減少。
目前關于HVKP的定義仍存在爭議。第一株HVKP分離自化膿性肝膿腫患者，該菌株同時具有高黏表型。此后，高黏表型被廣泛用作HVKP的標志，即拉絲實驗結果在5 mm及以上。但是，Russo等評估了拉絲實驗、毒力因子、莢膜分型等在HVKP檢測中的作用，發現拉絲實驗陽性菌株不一定具有黏液樣表型，具有高黏液特征的菌株拉絲實驗可呈陰性；盡管拉絲實驗檢測HVKP存在諸多問題，但其準確率可達90%；同時發現評價毒力準確率最高的毒力基因為iroB、iutA、rmpA和rmpA2，陽性率均超過95%。Yang等也發現HVKP的拉絲實驗未呈陽性，通過嗜中性粒細胞殺傷實驗和大蠟螟感染模型證實攜帶rmpA/rmpA2、沙門菌素相關基因iroBCDN和需氧菌素鐵攝入系統（iucABCD）的肺炎克雷伯菌具有較強的毒力。從臨床表現來看，HVKP多引起患者轉移性感染，如血流感染、化膿性肝膿腫、肺炎、膽道感染、軟組織疾病和自發性細菌性腹膜炎。納入本次研究的肺炎克雷伯菌均分離自血流感染患者，結合菌株的毒力特性（攜帶rmpA和iutA基因并具有高黏表型），本研究將符合這類特征的肺炎克雷伯菌定義為HVKP。本文資料中，共檢出1株CR-HVKP和36株CS-HVKP。
本文資料中這株CR-HVKP菌株分離自重癥監護病房的一例41歲女性血液腫瘤患者，雖然菌株對抗菌藥物的敏感性較好，但住院期間使用頭孢哌酮舒巴坦、利奈唑胺、莫西沙星和亞胺培南治療后預后仍不理想。經檢測，該株CR-HVKP不攜帶碳青霉烯酶基因，具有高黏表型，莢膜分型為K57，攜帶多種毒力基因（rmpA、iutA、entB、mrkD、fim），表現出較強的血清抵抗性和生物膜形成能力。進一步分析發現，CR-HVKP菌株攜帶blaSHV-145、blaTEM-1和blaCTX-M-3基因，OmpK35和OmpK36存在變異，MLST型別為412，推測該菌株對碳青霉烯類耐藥的機制是OmpK35/OmpK36異常伴隨ESBL的產生。Zhang等報道了一株MLST型別為65的CR-HVKP菌株，其攜帶blaCTX-3、blaDHA-1、blaSHV-11和blaTEM-53基因，伴隨OmpK35/OmpK36表達減少，同時表達ESBL基因，為K2莢膜型，且攜帶rmpA、aerobactin和entB毒力基因，對除替加環素外的抗菌藥物耐藥；Li等也報道了MLST型別為11型的CR-HVKP伴隨OmpK35/OmpK36缺失。結合本文資料，推測OmpK35/OmpK36變異可能與HVKP的毒力相關，但有待進一步研究證實。
綜上所述，CRKP對抗菌藥物的耐藥率明顯高于CSKP，雖然其攜帶的毒力基因數和種類均少于CSKP，但也出現了碳青霉烯類耐藥且高毒力的新型MLST型肺炎克雷伯菌。提示臨床和實驗室應關注這類病原菌，并結合患者臨床癥狀和實驗室提供的檢測結果盡早明確診斷，對患者提前進行干預治療，以期改善患者預后。
數據說明本研究提供的全基因組測序數據可在NCBI Sequence Read Archive（SRA）中獲得，檢索號為PRJNA786277
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