碳青霉烯類耐藥革蘭陰性菌聯合藥敏試驗方法學、流程、優缺點和結果判讀（二）
5聯合藥敏試驗結果判讀
常用部分抑菌濃度指數（fractional inhibitory concentration index，FIC）為判斷依據[18-19]，即①FIC≤0.5：協同作用，提示兩種藥物聯合后的抗菌活性顯著大于各單藥；②FIC＞0.5～1：相加作用，提示兩種藥物聯合后的抗菌活性較各單藥稍有增加；③FIC＞1～2：無關作用，提示兩種抗菌藥物的活性均不受另一種藥物的影響；④FIC＞2：拮抗作用，提示一種抗菌藥物的活性被另一種抗菌藥物削弱。
FIC指數計算公式：
專家共識三：在進行聯合藥敏試驗前，應先進行單藥的藥敏試驗，優先選擇敏感的抗菌藥物進行聯合，或以兩藥MIC值為中心，上下3～4個濃度進行交叉聯合，開展聯合藥敏試驗。
6聯合藥敏試驗方案推薦
由于不同種類的抗菌藥物對產生不同碳青霉烯酶菌株的體外抗菌活性不同，不同耐藥菌由于耐藥機制的差異導致其對抗菌藥物的敏感性不同。因此，應根據不同的CRO菌株制定不同的抗感染治療方案。如頭孢他啶-阿維巴坦對于產KPC酶或OXA-48型酶腸桿菌目細菌具有高度抗菌活性，但對于產金屬酶菌株需聯合氨曲南；替加環素對碳青霉烯類耐藥腸桿菌目細菌和鮑曼不動桿菌具有高度抗菌活性，但對銅綠假單胞菌無抗菌活性；而多黏菌素（包括多黏菌素B和黏菌素）對上述三種耐藥菌均具有高度抗菌活性（天然耐藥菌株除外）。除此之外，磷霉素對腸桿菌目細菌具有較強抗菌活性，但對銅綠假單胞菌和鮑曼不動桿菌基本無抗菌活性；阿米卡星對CRO菌株具有一定抗菌活性，需根據藥敏試驗情況而定；而頭孢哌酮-舒巴坦（尤其是舒巴坦加大劑量）對于CRAB仍具有一定抗菌活性[22-23]。基于此，實驗室在開展針對CRO菌株的聯合藥敏試驗時，需根據不同耐藥菌的特征而設計針對性的多藥聯合藥敏試驗方案。
專家共識四：各實驗室應根據本院CRO菌株耐藥機制，制定不同聯合藥敏試驗的抗菌藥物組合。
專家共識五：對于新β內酰胺類抗生素-β內酰胺酶抑制劑復方制劑，如頭孢他啶-阿維巴坦、美羅培南-韋博巴坦和亞胺培南-瑞來巴坦等，若藥敏試驗結果顯示對該類復方制劑敏感，可直接用于敏感菌所致感染的治療，無需開展聯合藥敏試驗。
專家共識六：對于不同CRO菌株聯合藥敏試驗抗菌藥物的選擇，應參考臨床抗感染治療指南或專家共識確定，具體參考表1[22-30]。
表1 CRO聯合藥敏試驗抗菌藥物組合推薦
7聯合藥敏試驗方法學簡介、優缺點和結果判讀（表2）
表2不同聯合藥敏試驗方法學簡介、結果報告、抗菌作用、優缺點、結果判讀和推薦級別
7.1肉湯微量稀釋棋盤法
肉湯微量稀釋棋盤法[16-17]用于測定抗菌藥物抑制或殺滅微生物的最低濃度，通常以mg/L為單位?？咕幬顰和抗菌藥物B經倍比系列稀釋后，以不同濃度組合進行混合，經過孵育后閱讀單藥及兩藥聯合后的MIC。肉湯微量稀釋法使用的96孔微量板在最終接種完成后通常每孔中液體終體積為0.1 mL，細菌終濃度為5×105CFU/mL。作為參考方法，肉湯微量稀釋棋盤法可精確測定細菌對抗菌藥物的敏感性，明確兩藥之間是否存在協同、相加、無關和拮抗作用（圖2和圖3）。但該方法比較耗時，工作量大且對方法學技術要求高，因此一般僅用于科學研究，常規實驗室通常較少開展。
圖2肉湯微量稀釋棋盤法協同、相加示意圖
圖3肉湯微量稀釋棋盤法無關、拮抗示意圖
7.2瓊脂稀釋棋盤法
瓊脂稀釋棋盤法[31]是將兩種抗菌藥物分別配制成單獨的不同濃度的溶液，之后以不同的兩藥藥物濃度組合加入到每一塊瓊脂平板中，配置成含抗菌藥物濃度成倍比系列稀釋的藥物平板。使用多點接種器將制備好的細菌菌懸液點種到瓊脂表面，經35℃16～20 h培養后，肉眼觀察細菌生長，以未見細菌生長平板的最低藥物濃度為MIC（圖4）。其優點是每個平板可同時測定多株細菌，可直接觀察受試菌生長是否良好或污染等。但該方法與肉湯微量稀釋棋盤法一樣比較耗時，工作量大且對方法學技術要求高，因此一般僅用于科學研究，常規實驗室通常較少開展。
圖4瓊脂稀釋棋盤法示意圖
7.3紙條法
紙條法[17，21，32-34]亦稱梯度擴散法，所用材料名稱為E試驗條（Epsilometer，E-test）和MIC測試條（MIC test strip，MTS），是一種商品化的定量測定細菌對抗菌藥物敏感性的方法。它結合了稀釋法和擴散法的原理和特點，操作同紙片擴散法一樣簡便易行，結果又如同稀釋法一樣，可獲得定量的MIC值，結果準確，重復性好。紙條法包括兩種：①紙條優加法，操作時在一塊已涂布菌液的MHA平板上貼上含抗菌藥物A和抗菌藥物B的紙條；在另一塊已涂布菌液的MHA平板上先貼上含抗菌藥物A的紙條，30 min后，待抗菌藥物A完全滲透入瓊脂中后移去紙條，再在相同的位置覆蓋貼上抗菌藥物B。過夜孵育后閱讀抗菌藥物A單藥、抗菌藥物B單藥以及抗菌藥物A和抗菌藥物B堆疊后的MIC（圖5）。②紙條交叉法：抗菌藥物A和抗菌藥物B紙條垂直交叉放置（單藥MIC處交叉，因此需提前測定單藥MIC），孵育后閱讀聯合后抗菌藥物A和抗菌藥物B的MIC，計算FIC指數，判斷兩藥是否存在協同、相加、無關和拮抗作用（圖6）。紙條法具有操作簡單的特點，且結果容易閱讀。
圖6紙條交叉法聯合藥敏試驗
專家共識七：兩藥協同定義為該菌對抗菌藥物A和抗菌藥物B單藥均為耐藥，但抗菌藥物B在抗菌藥物A存在時表現為敏感或中介。
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