膿腫分枝桿菌胞內(nèi)菌落計數(shù)、對RAW264.7細胞血紅素氧化酶1調(diào)控自噬影響（三）
1.2.6胞內(nèi)菌落計數(shù)
細胞內(nèi)菌落計數(shù)操作如下：培養(yǎng)并調(diào)整RAW264.7細胞濃度2.5×105個/ml，取2 ml加到6孔板中，待細胞完全貼壁后，分別加入終濃度分別為30μmol/L CoPP和30μmol/L SnPP預處理12 h，加入M.abs（MOI=5）共孵育2 h，無菌PBS漂洗3次，加入含34μg/ml阿米卡星完全培養(yǎng)基作用2 h以清除胞外M.abs，無菌PBS漂洗后繼續(xù)加入終濃度30μmol/L CoPP和30μmol/L SnPP繼續(xù)培養(yǎng)48 h。刺激完畢，棄上清，無菌PBS漂洗3次，加入300μl無菌去離子水裂解細胞，振蕩混勻后置冰上裂解20 min，加入含0.1%SDS、5%BSA無菌裂解液1 ml進一步裂解細胞，將裂解液吸入無菌EP管，13 000 r/min離心15 min，棄上清，加入300μl無菌7H9培養(yǎng)基重懸沉淀。取50μl懸液放入96孔板進行倍比稀釋，每個稀釋度取10μl接種于哥倫比亞血平板，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3~5 d，進行菌落計數(shù)，各組菌落計數(shù)結(jié)果與M.abs對照組進行標準化處理后進行統(tǒng)計學分析。
1.2.7 ELISA實驗
細胞按照實驗設計處理完成后，ELISA檢測TNF-α蛋白分泌。按照試劑說明書進行操作，吸取100μl培養(yǎng)上清液、標準品加到96孔酶聯(lián)板中37℃孵育1 h，棄上清，每孔加入A工作液100μl，封板，37℃孵育1 h；棄上清，每孔加入350μl洗液，洗板3次，每次2 min，最后一次用吸水紙把殘留液體吸干；每孔加入B工作液100μl，封板，37℃孵育30 min；洗板3次，每次2 min，每孔加入90μl基質(zhì)液，37℃避光孵育10~20 min；每孔加入50μl終止液，置波長450 nm酶標儀比色。
1.3統(tǒng)計學分析
所有Western blot圖片灰度值均由Image J軟件進行計算，所得的數(shù)據(jù)均由Excel收集，并采用Prism8.0繪圖，SPSS20.0進行統(tǒng)計分析。各組之間比較采用one-way ANOVA分析，Levene檢驗方差齊性，方差不齊采用Dunnett T3方法比較，P<0.05認為差異具有統(tǒng)計學意義。
2結(jié)果
2.1 M.abs對RAW264.7細胞HO-1表達影響
如圖1A、B結(jié)果所示，與無菌對照組比較，M.abs在MOI=5時，HO-1表達最高，MOI=10、15時，HO-1表達量逐漸減少（P<0.001）。圖1C、D結(jié)果顯示，與0 h相比較，M.abs刺激8~24 h，HO-1表達升高，24 h達到最高峰，但24~48 h后有表達下降趨勢（P<0.001）。CCK-8檢測細胞活性結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與無菌對照組相比，M.abs與RAW264.7細胞共孵育48 h，細胞活性無顯著改變（圖1E）。
圖1 M.abs對RAW264.7細胞HO-1表達的影響
2.2 M.abs誘導RAW264.7細胞自噬蛋白表達
圖2結(jié)果顯示，隨著MOI的增加，Atg5、LC3Ⅱ蛋白表達量逐漸增加，自噬流標志物p62蛋白表達量也增加。說明M.abs誘導自噬小體形成的同時，自噬溶酶體降解受阻。
圖2 M.abs對RAW264.7細胞自噬流表達影響
2.3 HO-1參與調(diào)控M.abs誘導的自噬相關蛋白表達
圖3結(jié)果顯示，30μmol/L CoPP能誘導HO-1大量表達，顯著抑制Atg5、LC3Ⅱ表達，增加p62聚集。30μmol/L SnPP顯著增加Atg5表達和LC3Ⅱ表達，p62減少。圖3F結(jié)果顯示，單獨30μmol/L CoPP和30μmol/L SnPP與細胞共孵育48 h，CCK-8檢測細胞活性無顯著差異。
圖3 M.abs誘導的RAW264.7細胞自噬受HO-1調(diào)控
2.4抑制HO-1增加溶酶體酸性區(qū)域改變
LysoTracker Red溶酶體染色結(jié)果顯示（圖4A），與M.abs組相比較，M.abs+CoPP組胞漿溶酶體熒光比M.abs熒光稍弱，SnPP+M.abs組胞漿溶酶體表達顯著增多（紅色區(qū)域），而3-MA+M.abs組和BafA1+M.abs組胞漿溶酶體顯著減少。圖4B結(jié)果為各組溶酶體（紅色區(qū)域）平均熒光值定量結(jié)果，SnPP+M.abs組與各組相比差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.001）。
圖4 HO-1調(diào)節(jié)M.abs感染的溶酶體酸性區(qū)室改變
2.5抑制HO-1減少M.abs胞內(nèi)存活及炎癥反應
采用30μmol/L CoPP和30μmol/L SnPP分別與M.abs共孵育48 h，CCK-8結(jié)果顯示，各組中M.abs細菌活性差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05，圖5A），說明此濃度的CoPP和SnPP對M.abs生長沒有抑制作用。細胞內(nèi)菌落計數(shù)結(jié)果顯示，與M.abs組比較，CoPP+M.abs組胞內(nèi)菌落計數(shù)差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），而SnPP+M.abs組胞內(nèi)菌落計數(shù)顯著減少，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.001，圖5B）。CCK-8檢測胞內(nèi)細菌活性結(jié)果和胞內(nèi)菌落計數(shù)結(jié)果相似（圖5C）。ELISA結(jié)果顯示，與M.abs組比較，SnPP+M.abs組TNF-α蛋白分泌顯著減少（圖5D），差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.001）。
圖5抑制HO-1減少RAW264.7胞內(nèi)M.abs生長和TNF-α分泌
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