金黃色葡萄球菌：紅霉素、慶大霉素和氧氟沙星時間-抑菌生長曲線分析（二）
1.4.4濁度法-體外藥物敏感性試驗
根據質控菌和試驗菌的微量稀釋法-藥物敏感性試驗獲得的MIC值，分別用水稀釋成4個不同的藥物濃度，備用。向比濁管中按拉丁方排列加入配制好的系列濃度藥物1.00mL，再加入9.00mL適宜濃度的菌懸液，使菌液終濃度為5×105cfu/mL，藥物終濃度分別為MIC、1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC。
表1金黃色葡萄球菌藥敏判定標準和質控范圍
表2不同藥物濃度拉丁方排列方式
將添加有不同濃度藥物、菌液混懸液的比濁管放入到WBS-100微生物比濁法測定儀中，培養溫度為37℃，監測間隔時間為30min，監測時長為16h，測定實時吸光度。試驗結束后通過不同時間節點的吸光度值使用Excel繪制其時間-吸光度抑菌生長曲線。
2結果與分析
如表3所示，微量稀釋法-藥物敏感性試驗測得的MIC結果與濁度法測得的結果無顯著差異，但濁度法試驗為實時吸光值信號采集，獲得的結果可能更接近實際的MIC值，而通過時間-吸光度曲線進行MIC終點判讀則更直觀和準確。
如圖1所示，3種藥物的分離菌株生長曲線都是前期呈不斷增長的趨勢，到后期明顯逐漸下降，而質控菌株呈現增長的趨勢，下降趨勢不明顯；不論是分離菌株還是質控菌株，呈現的生長曲線的1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC曲線下面積不同；1/8MIC先于1/4MIC進入對數生長期，1/4MIC先于1/2MIC進入對數生長期；紅霉素、慶大霉素的分離菌1/2MIC先于質控菌1/2MIC進入對數生長期；氧氟沙星為快速殺菌劑，其1/2MIC進入對數生長期較紅霉素和慶大霉素早。紅霉素為時間依賴型抗生素，其抑菌時間比慶大霉素和氧氟沙星都要長。。
通過紅霉素、慶大霉素和氧氟沙星3種藥物的時間-抑菌生長曲線分析，可以發現金黃色葡萄球菌在亞抑菌濃度（1/2 MIC）的壓力下，其生長趨勢呈現了不同于理論設想的情況，可能并非是細菌抑制或殺死其生長量絕對值的一半。
表3 3種抗菌藥物對金黃色葡萄球菌的MIC
圖1金黃色葡萄球菌在3種抗菌藥物作用下的時間-吸光度曲線
圖2質控菌株ATCC29213在3種抗菌藥物作用下的時間-吸光度曲線
3討論與結論
已有研究表明，亞抑菌濃度下細菌耐藥基因的水平傳播可能性增加，突變株數量大于野生株數量，還會形成生物膜，這些都可導致耐藥性的產生，而亞抑菌濃度的藥物壓力下，耐藥菌株還會被選擇性富集，因此亞抑菌濃度下細菌與藥物的作用關系很有研究價值。不同藥物濃度下金黃色葡萄球菌進入對數生長期的時間有顯著差異，高濃度藥物下的金黃色葡萄球菌進入對數生長期較低濃度藥物有一定的延遲，目前還不明確金黃色葡萄球菌在亞抑菌濃度下是否會蓄積不同耐藥機制的耐藥菌株，即藥物壓力下快速進入對數期的細菌可能為獲得耐藥性的細菌。但也有研究證實，發生突變的高水平耐藥菌的適應性與其親本株相比大多數出現適應性下降；耐藥金黃色葡萄球菌的生長曲線呈現先增長后減小的趨勢；濁度法下的時間-抑菌生長曲線可清楚地對不同依賴型藥物的抑菌殺菌時間進行可視化判定，慶大霉素、氧氟沙星為濃度依賴型，可見不同藥物濃度對細菌生長繁殖影響較大，而紅霉素為時間依賴型，隨著時間的延長，不同藥物濃度的抑菌時間均比慶大霉素、氧氟沙星長，提示時間依賴型藥物的抑菌時間均比濃度依賴型藥物長。
濁度法較微量稀釋法比較具有5點優勢：（1）濁度法可以進行實時監控，測定其實時吸光值，反映金黃色葡萄球菌生長的動態趨勢，微量稀釋法只能在第2 d觀察結果；（2）濁度法可以使用現有的濁度分析儀，實現自動化數據采集；（3）濁度法結合振搖培養，保證了藥物與細菌的充分作用；（4）濁度法終點判讀時更直觀；（5）濁度法可清楚地對不同依賴型藥物的抑菌殺菌時間進行可視化判定。
通過紅霉素、慶大霉素和氧氟沙星3種藥物的時間-抑菌生長曲線分析，金黃色葡萄球菌在亞抑菌濃度（1/2 MIC）的壓力下，可能并非是細菌抑制或殺死其生長量絕對值的一半；不同藥物濃度下金黃色葡萄球菌進入對數生長期的時間有顯著差異，高濃度藥物下的金黃色葡萄球菌進入對數生長期較低濃度藥物有一定的延遲；耐藥金黃色葡萄球菌的生長曲線呈現先增長后減小的趨勢；隨著時間的延長，不同藥物濃度的紅霉素抑菌時間均比慶大霉素、氧氟沙星長。
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