臨床結核分枝桿菌體外藥敏試驗：分子DST檢測VS表型DST藥敏診斷技術（一）
摘要:目的比較結核分枝桿菌表型藥敏與快速分子檢測結果的一致性。方法回顧性分析2017年1月至2020年12月浙江省嘉興市第一醫院確診的1750例涂陽肺結核患者痰液、肺泡灌洗液等標本，同時進行結核菌表型藥敏及快速分子檢測，對兩種檢測結果的一致性進行比較，并對不一致的原因進行分析。結果1750例患者按流程操作共檢測得到結核分枝桿菌菌株1596例（91.20%），其中1542例利福平（RFP）兩種方法檢測結果一致（敏感1478例，耐藥64例），一致率為96.62%;54例RFP不一致（3.38%）。1520例異煙肼（INH）兩種方法檢測結果一致（敏感1465例，耐藥55例），一致率為95.24%;76例INH不一致（4.76%）。利福平（RFP）ropB基因突變位點分子檢測檢出率為94.79%（91/96），表型藥敏檢出率為93.02%（80/86）。異煙肼（INH）katG、inhA基因突變位點分子檢測檢出率為95.79%（91/95），表型藥敏檢出率為87.91%（80/91）。分析兩種檢測結果不一致的原因有檢測標本不一致、檢測技術局限性、不同突變類型、靜默突變、異質性耐藥及其他耐藥機制。結論結核分枝桿菌表型藥敏與分子檢測結果的一致性高，差異無統計學意義，臨床上擴大分子藥敏作為初始診斷工具，可取得早診治、早防控的效果;當檢測結果不一致時，應及時分析原因，建議有條件的結核病定點醫院使用兩種檢測方法平行檢測以提高精準度。
結核病是由結核分枝桿菌（mycobacterium tuberculosis，M.tb）引起的呼吸道傳染性疾病。耐多藥結核病（multidrug-resistant tuberculosis，MDR-TB）的流行是結核發病率居高不下的重要原因，也是世界性的公共衛生問題。耐藥結核病的診斷主要依靠體外藥物敏感性試驗（drug susceptibility testing，DST）。根據WHO指南，耐多藥/利福平耐藥結核?。╮ifampicin resistant tuberculosis，MDR/RR-TB）的發現首先需要細菌學確認，進一步行快速分子檢測、痰培養或基因測序檢測結核菌耐藥情況。因此，正確判讀快速分子檢測與表型藥敏檢測結果，選擇精準方案及療程具有十分重要的意義。本研究收集2017年1月至2020年12月浙江省嘉興市第一醫院臨床診斷為結核病患者的痰液、肺泡灌洗液等標本1750份，行快速分子檢測表型藥敏試驗，現報道如下。
1材料與方法
1.1病例及菌株來源
入選病例菌株均來自2017年1月至2020年12月浙江省嘉興市第一醫院結核門診及住院的涂陽肺結核患者痰液、肺泡灌洗液標本，行快速分子檢測（Xpert MTB/RIF、基因芯片）及結核菌培養（羅氏固體培養及液體BACTEC MGIT960培養）并進行藥敏試驗，共計1750例。
1.2方法
1.2.1 Xpert MTB/RIF檢測系統
痰樣本前處理。收集1～4 ml痰液樣本置于一次性的防漏容器中，在Xpert MTB/RIF檢測匣側壁標記樣本序號（ID）。打開裝有痰液樣本的容器，加入痰液樣本2倍體積的樣本試劑（sample reagent，SR）。蓋上蓋子，劇烈搖動10～20次或渦旋震蕩至少10 s。將混合好的樣本在20～30℃孵育15 min。在孵育進行到5～10 min時，再次劇烈搖動裝有痰液樣本的容器10～20次或渦旋震蕩至少10 s。視樣本性狀，將1～2倍體積的4%氫氧化鈉（NaOH）加入前處理管中，旋緊處理管的螺旋蓋，在渦旋振蕩器上振蕩1 min左右直至痰樣本充分液化，將前處理管置于生物安全柜內，室溫靜置15 min;將45 ml磷酸緩沖鹽溶液（phosphoric acid buffer salt solution，PBS）加入液化好的痰液中，旋緊螺旋蓋，將前處理管在3000 r/min離心20 min;去上清，加入2 ml PBS。將樣品加入檢測匣后，打開檢測匣的蓋子，將處理后的樣品由檢測匣的加樣孔緩慢加入。見圖1。關閉檢測匣的蓋子，開始檢測，GeneXpert Dx軟件自動讀取信息進行自動檢測。
1.2.2基因芯片檢測系統
采用DNA微陣列芯片法進行菌種鑒定，使用博奧生物分枝桿菌菌種鑒定試劑盒，具體步驟如下。①從固體培養基上挑取菌落于含核酸提取液的核酸提取管中;液體培養基內吸取≥1個麥氏濁度的菌懸液10～20μl于含核酸提取液的核酸提取管中;使用Extractor 36核酸快速提取儀振蕩5 min，95℃水浴5 min，5000 r/mim離心1 min，得到的核酸放置-20℃暫存。②在標本制備區內進行PCR擴增反應、芯片雜交、芯片的洗滌與干燥等步驟，甩干后掃描。③使用晶芯微陣列芯片掃描儀LuxScan10K-B和相應軟件進行信號的讀取及結果判讀。陽性判斷值：對于IC（分枝桿菌屬）探針和結核分枝桿菌探針通過ROC方法確定其陽性判斷值。對于其他16種非結核分枝桿菌檢測探針均通過百分位數法確定其陽性判斷值。當探針信號值大于或等于該探針的陽性判斷值，則該探針判讀為陽性;當探針信號值小于該探針的陽性判斷值，則該探針判讀為陰性。試劑盒中各探針的陽性判斷值已整合到相應判讀軟件中，由軟件自動對樣品檢測結果進行判別。
1.2.3臨床結核分枝桿菌的培養及體外藥敏試驗
（1）結核分枝桿菌固體培養。①前處理方法：痰液中加2～4倍量2%NaOH，振蕩器振蕩5～10 min，或置室溫30 min、其間振蕩2～3次，使痰液化。取前處理液化后痰液0.1 ml，無菌操作接種于培養基斜面上，每份標本同時接種兩支酸性改良羅氏培養基，置37℃孵育。對培養陽性的菌株進行分枝桿菌菌群鑒定，在試劑瓶中加入對硝基苯甲酸（PNB）和噻吩二羧酸肼（TCH）試劑，觀察菌株生長指數，如繼續生長為非結核分枝桿菌，如生長受到抑制則為結核分枝桿菌。②藥物敏感性檢測：選擇4種常用的一線抗結核藥物（異煙肼、利福平、鏈霉素、乙胺丁醇）進行體外藥物敏感試驗，抗結核藥物濃度分別為異煙肼0.1 mg/L、利福平1.0 mg/L、鏈霉素1.0 mg/L、乙胺丁醇5.0 mg/L，采用WHO/國際防癆與肺部疾病聯合會《耐藥檢測指南》推薦的比例法。
（2）結核分枝桿菌960液體培養。①培養管準備：MGIT營養添加劑（0.5%甘油，0.5%牛血清白蛋白，0.2%葡萄糖，140 mmol/L NaCl，OADC）為15 ml液體試劑，可直接使用，在每一根培養管中加入800μl MGIT營養添加劑備用。②樣本準備：挑取1～2 ml膿性痰液部分至標記的50 ml離心試管中;加等量的2%N-乙酰半胱氨酸-氫氧化鈉-枸櫞酸鈉前處理液;漩渦震蕩20 s;靜置15 min;加無菌PBS（pH=6.8）至約50 ml，蓋緊蓋子;離心3000 r/min，15 min;倒掉上清液;添加1～3 ml PBS以中和pH值至6.8。③樣本接種：將上述預處理好的樣本接種500μl至MGIT培養管中。④MGIT培養管裝載至BACTECMGIT 960 System全自動分枝桿菌檢測/藥敏系統孵育培養。
1.3統計學方法
采用SPSS 13.0統計學軟件進行數據處理，計數資料以[n（%）]表示，組間比較采用χ2檢驗（或Mc Nem），P<0.05為差異有統計學意義。通過Kappa檢驗分析兩種方法一致性（Kappa>0.75，一致性較好;0.40～0.75，一致性一般;<0.40，一致性較差）。
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